鲍鱼贮藏过程中细菌的多样性

刘 馨 月, 张 公 亮, 王 佳 莹, 刘 丽, 侯 红 漫

( 大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

鲍鱼含有丰富的营养物质，口感独特，有很高的食用价值。但是，鲍鱼在食用和使用过程中极易发生腐败变质，失去特有的风味和丰富的营养[1]。Dalgaard[2]研究认为，在多数情况下，部分微生物参与食品的腐败过程。水产品加工过程中，环境温度一般控制在0～15 ℃或更高，在夏季由于天气的原因温度较高，水产品更容易腐败变质，了解鲍鱼在4和20 ℃贮藏过程中细菌的种类，进而有针对性地采取相应措施，以提高鲍鱼的食用价值。因此了解鲍鱼贮藏过程中的细菌多样性十分必要。对于水产品中细菌多样性的研究多采用传统培养法，再根据各种的表型观察鉴定，但由于某些表型不是特有表型，会导致鉴定错误[3]；有些细菌目前还不能被人为培养，从而导致多样性分析不够全面准确。目前，出现了许多分子生物学的方法，能快速而准确的检测微生物，包括变性梯度凝胶电泳、454焦磷酸测序和限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)等[4]。

本实验采用PCR-RFLP方法研究鲍鱼在冷藏(4 ℃)和常温(20 ℃)贮藏过程中细菌菌群的多样性，以期更加全面准确地了解鲍鱼在贮藏过程中细菌的种类及变化规律。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

PCR扩增仪，美国伯乐公司；JM-250电泳仪，大连捷迈科贸有限公司；凝胶成像仪，美国伯乐公司；MicroOne掌上离心机，日本TOMY公司。

1.2 主要试剂

DNeasy blood & tissue kit，德国Qiagen；LA Taq酶，Ex Taq Version 2.0，pMD19-T载体，大肠杆菌JM109，HaeⅢ、HinfⅠ，宝生物大连有限公司；1 492r、27f、RV-M、M13、IPTG、X-Gal，生工生物(上海)有限公司。

1.3 样品及前处理

2016年7月于大连长兴市场购买新鲜皱纹盘鲍，活体运回实验室。去壳去内脏，用无菌袋包装置于4和20 ℃贮藏。每个取样点取3个平行，每个温度取4个时间点。4 ℃时间点为0、6、12、18 d，20 ℃时间点为0、24、48、72 h。

1.4 鲍鱼中细菌总DNA提取和PCR扩增

取鲍鱼肉15 g，转移到45 mL已灭菌的1×PBS中，300 r/min振荡10 min，使细菌充分洗脱，在4 ℃下800 r/min离心10 min，取上清；上清液7 000 r/min离心10 min后，收集菌体沉淀，于-80 ℃保存以备提取细菌总DNA。

将菌体沉淀参照说明书进行后续操作。结果在1%的琼脂糖凝胶电泳上检测。将提取的DNA进行混合，并放置在-20 ℃下保存，备用。

PCR选择细菌的通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492r(5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行扩增，片段长度约为1 500 bp[5]。反应扩增体系为50 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，58 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸45 s，30个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物切胶，经试剂盒回收。

1.5 蓝白斑筛选阳性克隆子

1.5.1 连接、转化及阳性克隆子的筛选

回收后的PCR产物与pMD19-T过夜连接，再转入E.coli感受态细胞JM109中，转化后的细胞37 ℃下培养12～16 h，进行蓝白班筛选转化子。挑取阳性克隆子，采用载体通用引物RV-M和M13-47重新扩增插入片段，1%琼脂糖电泳检测，将正确的克隆子进行二次PCR扩增。

1.5.2 限制性片段多态性分析和测序

经过PCR扩增后得到的不同的16S rDNA片段，采用限制性内切酶HinfⅠ和HaeⅢ[6]在37 ℃进行特异性酶切3 h。将具有不同酶切谱型的二次PCR产物送交至生工生物有限公司进行测序。

1.6 结果分析

测序结果在NCBI网站的BLAST程序与GenBank数据库中的序列进行相似性比较分析，鉴定细菌种类。对鉴定后的菌种通过MAGE6.0构建系统发育树。

2 结果与讨论

2.1 鲍鱼中细菌总DNA的提取及PCR扩增

从鲍鱼中获得的可直接进行PCR扩增的细菌总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测和酶标仪检测，DNA的OD 260/280均在1.7～1.9，符合DNA纯度要求。并以提取的DNA为模板，采用细菌通用引物(27f和1 492r)进行PCR扩增，得到的目的片段长度1 500 bp，结果如图1所示。其结果与细菌通用引物的大小相同，为实验所需片段，对PCR产物进行切胶回收。

M，2 000 bp的DNA marker；1～7，PCR产物

2.2 蓝白班筛选阳性克隆子

2.2.1 连接、转化及阳性克隆子的筛选

将切胶回收后的PCR产物与pMD19-T以质量比10∶1混合过夜连接，导入E.coli感受态细胞JM109中，37 ℃培养14 h。在4 ℃显色3 h。随机挑取200个白斑进行菌落PCR，产物在1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.2.2 限制性片段多态性分析和测序

以挑取的阳性克隆子为模板，细菌的通用引物(27f和1 492r)进行二次PCR扩增，扩增后的产物用HinfⅠ和HeaⅢ限制性内切酶进行双酶切，酶切产物见图2。根据酶切位点的不同，将PCR产物切成片段大小不同的条带，得到不同酶切条带如表1所示。

M，100 bp的DNA marker；1～24，酶切产物

表1 PCR产物的不同酶切图谱个数

经过限制性片段多态分析后得到不同的酶切图谱，将其二次克隆的PCR产物送至生工生物测序，测序后得到的序列在与GenBank数据库的序列进行比对，结果经过统计分析后得到鲍鱼贮藏过程中细菌种类及种属个数的分布，如表2所示。

表2 鲍鱼在4和20 ℃贮藏过程中细菌的种类、菌株数量及其分布

通过Blast中的序列比对和对细菌种类的归类分析，发现鲍鱼贮藏过程中共有6个系统类群，为变形杆菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicute)和未分类的细菌(Unclassified)。其中变形杆菌门为鲍鱼主要菌群组成成分，在贮藏初期尤为明显，这一结果与国内外产品中微生物多样性的研究结果相类似。比对后得到20种(属)细菌，分别为嗜冷单胞菌属、弓形杆菌、弧菌、发光杆菌、乳球菌、黄杆菌和梭形杆菌属等。在贮藏过程中，弧菌和弓形杆菌的种类有先增加后减少的变化趋势。在贮藏末期，依据细菌的种类占总细菌种类比例的多少，得到鲍鱼在贮藏末期时的优势菌。在20 ℃ 贮藏72 h 的优势菌为乳酸乳球菌(30%)，4 ℃ 贮藏18 d 的优势菌为梭杆菌(29%)。

由表2可知，贮藏初期新鲜的鲍鱼中细菌组成成分复杂，随着时间的增加，细菌组成成分变得单一。初始点细菌种类较多，主要与其生活环境及捕捞时的季节和卫生状况等多种因素相关[7]。在4和20 ℃贮藏过程中，变形杆菌门均有存在，其中的弧菌和弓形杆菌均出现明显地增加，到贮藏后期又降低，弧菌在20 ℃贮藏后期消失。曹荣[8]对太平洋牡蛎的研究中加入自制保鲜剂后其贮藏后期的优势菌群为乳球菌，本实验20 ℃贮藏后期的优势菌群也为乳球菌。

图3 4和20 ℃贮藏过程中鲍鱼细菌的多样性及分布

根据测序得到的序列构建部分菌株的系统发育树如图4所示。两个系统发育树均为两大同源关系分支，其中Ahrensiakielensis和Psychromonassp.、Vibrio和Arcobacter、Ilyobacter和Fusobacterium同源关系较近。

罗庆华[9]研究发现，水产品在有氧冷藏中，贮藏后期细菌多为假单胞菌或腐败希瓦氏菌，在本研究中未鉴定出这两种细菌，可能的原因是产品的种类、栖息水域、捕获方式、季节或贮藏条件及方式等的差异导致。

3 结 论

鲍鱼在冷藏(4 ℃)和常温(20 ℃)贮藏过中，细菌的多样性整体呈下降趋势。贮藏初期样品中优势类群为变形杆菌门和未分类的细菌。贮藏中期弧菌和弓形杆菌有明显的增加。4 ℃贮藏18 d的优势系统类群为梭杆菌门；20 ℃贮藏7 h时，厚壁菌门为优势系统类群，优势菌分别为梭杆菌和乳酸乳球菌。通过RFLP方法研究鲍鱼的细菌菌群多样性，避免了传统方法中不可培养的细菌引起的误差，还可以通过对测序结果的分析，判定其同源关系的远近，以便更好地利用鲍鱼及其相关产品。

[1] 袁超,赵峰,周德庆,等.超高压处理对冷藏鲍鱼保鲜效果与品质变化的影响[J].食品工业科技,2015,36(17):312-317.

[2] DALGAARD P. Quality and quantitative characterization of spoilage bacteria from packed fish[J]. International Journal of Food Microbiology, 1995, 26(3): 319-333.

[3] 郑瑞生,陈凉凉,肖熙.熟制鲍鱼残留细菌的分离及16S rDNA鉴定[J].食品科学技术学报,2013,31(4):32-36.

[4] CHEN H B, LIU Z Y, WANG M Y, et al. Characterisation of the spoilage bacterial microbiota in oyster gills during storage at different temperatures[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(15): 3748-3754.

[5] 樊奔,崔忠利,邱珊莲.等.以质粒载体构建土壤宏基因组文库的研究[J].土壤学报,2006,43(3):513-516.

[6] KIM M S, PARK E J. Bacterial communities of traditional salted and fermented seafoods from Jeju Island of Korea using 16S rRNA gene clone library analysis[J]. Journal of Food Science, 2014, 79(5): M927-M934.

(a) 20 ℃

(b) 4 ℃

图4 鲍鱼两种贮藏条件下的细菌系统发育树

Fig.4 Phylogenetic trees of bacteria in abalone at two kinds of storage conditions

[7] 沈萍,李学英.低温贮藏过程中鱿鱼细菌组成的变化及优势腐败菌鉴定[J].现代食品科技,2015,31(6):236-242.

[8] 曹荣.太平洋牡蛎在冷藏和冻藏过程中细菌菌相及品

质变化[D].青岛:中国海洋大学,2006.

[9] 罗庆华.水产品特定腐败菌研究进展[J].食品科学,2010,31(23):468-472.