液相色谱-原子荧光光谱法分析测定水产动物及其制品中不同形态汞的含量

王林裴,周迎春,郑亚哲,华向美,彭新然,*

(1.漯河出入境检验检疫局,河南漯河 462000;2.北京启迪桑德环境资源股份有限公司,北京 101102)

汞是一种常见的污染物,它可以在微生物的甲基化作用下转化为甲基汞。汞化合物的毒性依赖于其浓度及化学形态,烷基汞的毒性比芳基汞和无机汞大,甲基汞是毒性最强的汞化合物之一[1]。甲基汞通过食物链可以危害人体健康,对人体中枢神经系统造成不可逆的损害[2-3]。基于汞形态毒性的差异[4-5],仅测定食品中的总汞含量已远不能满足评价汞毒性的需求,并且农业行业标准NY 5073-2006 《无公害食品:水产品中有毒有害物质限量》[6]要求所有水产品甲基汞含量不得大于0.5 mg/kg。因此采用高灵敏度的形态分析测定方法测定食品中的汞含量非常必要[7-8]。

食品中汞的形态分析也是近年来研究的热点问题。目前汞形态分析主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[9]、高效液相色谱与紫外检测器联用法(HPLC-UV)[10]、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用(HPLC-ICP-MS)[11-14]等技术。但是气相色谱法需要将汞衍生化处理成气态化合物,经过萃取才可上机测定,过程繁琐;HPLC-UV对流动相要求较高,且消耗有机物量很大,灵敏度较低;HPLC-ICP-MS虽然检出限较低,精密度高,但是仪器成本及维护费用较高,没有得到普遍应用。而液相色谱与原子荧光联用[15-16]技术不仅具有检出限低、重现性好、稳定性高等优点,而且成本较低,故可得到广泛应用。本文主要通过摸索尝试,建立合适的样品提取、净化的前处理方法,以减少杂质对测定的干扰因素。同时对高效液相色谱条件、形态分析预处理装置和原子荧光的工作条件进行优化,建立适用于水产动物及其制品中不同形态汞的分离检测方法,为今后汞形态测定分析研究提供方法依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲基汞(MeHg)标准品(65.5 μg/g)、乙基汞(EtHg)标准品(76.4 μg/g) 中国计量科学研究院;二价汞(Hg2+)标准溶液(10 μg/mL) 安捷伦科技有限公司产品;L-半胱氨酸(优级纯)、醋酸铵(优级纯)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、氨水(分析纯) 漯河市源汇区双丰化学试剂经营部；另外实验所用容器使用前均用25% HNO3溶液浸泡过夜。

液相色谱-原子荧光联用仪(LC-AFS) 液相色谱仪包括液相色谱泵和手动进样阀;AFS-933原子荧光光谱仪、SA-20形态分析预处理器 北京吉天仪器有限公司;AF-2汞空心阴极灯 北京有色金属研究总院;Milli-Q Element超纯水仪 美国Millipore公司;KQ5200DE超声清洗仪 中国昆山超声仪器有限公司;EPPENDPRF～5810R型超高速冷冻型离心机 德国艾本德公司;PHS-3C酸度计 上海雷磁仪电科学仪器股份有限公司;AB265-S型分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制 甲基汞(MeHg)、乙基汞(EtHg)标准储备液:标准溶液分别转入10 mL容量瓶配制成10 μg/mL的标准溶液,避光保存在4 ℃冰箱中。无机汞(Hg2+)标准储备液:取适量标准溶液,以2%硝酸逐级稀释成浓度为10 μg/mL的标准储备液。混合标准中间液:分别移取适量的MeHg、EtHg、Hg2+标准储备液,用流动相(5%甲醇+0.06 mol/L乙酸铵+0.1% L-半胱氨酸)逐级稀释成浓度为1.0 μg/mL的汞多形态混合标准溶液。标准曲线的配制:将配制好的三种形态汞标准溶液中间液用流动相逐级稀释,配制成实验所需要的0.0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 ng/mL的混合标准溶液系列,现用现配。

1.2.2 色谱条件的优化

1.2.2.1 流动相的选择 配制两种不同的流动相,分别为5%甲醇+0.06 mol/L乙酸铵+0.1% L-半胱氨酸和5%的乙腈+0.06 mol/L乙酸铵+0.1% L-半胱氨酸两种流动相,采用Athena C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),均调节pH为7.00,流速=0.8 mL/min,进样量:100 μL,柱温:25 ℃,原子荧光工作条件见1.2.3(HCl浓度:7.0%;KHB4溶液浓度:2.0%),用这两种流动相作对比,重复进样以选择最佳流动相。

1.2.2.2 流动相pH的选择 分别配制不同pH的5%甲醇+0.06 mol/L乙酸铵+0.1% L-半胱氨酸溶液,流速=0.8 mL/min,进样量:100 μL,柱温:25 ℃,原子荧光工作条件如1.2.3(HCl浓度:7.0%;KHB4溶液浓度:2.0%),重复进样,比较3种不同汞形态的分离效果。

1.2.2.3 流速的选择 流动相:5%甲醇+0.06 mol/L乙酸铵+0.1% L-半胱氨酸(pH=7.01),进样量:100 μL,柱温:25 ℃,原子荧光工作条件如1.2.3(HCl浓度:7.0%,KHB4溶液浓度:2.0%),只改变流速(分别设置为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min),观察仪器响应值,重复进样从而优化选择。

1.2.2.4 进样体积的优化 流动相:5%甲醇+0.06 mol/L乙酸铵+0.1% L-半胱氨酸(pH=7.01),流速:0.8 mL/min,柱温:25 ℃,原子荧光工作条件如1.2.3(HCl浓度:7.0%,KHB4溶液浓度:2.0%),依次用20、40、60、80、100、120、140、150 μL混标溶液进行测试,重复进样观察其信号响应情况,选择最佳。

1.2.3 原子荧光光谱条件的优化

1.2.3.1 还原剂(KHB4)浓度的选择 流动相:5%甲醇+0.06 mol/L乙酸铵+0.1% L-半胱氨酸(pH=7.01),进样量=100 μL,柱温:25 ℃,流速:0.8 mL/min,配制0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%浓度梯度的KHB4溶液,载流(HCl)浓度为7.0%,负高压:300 V,Hg灯总电流:35 mA,载气流速:300 mL/min,屏蔽气流速:500 mL/min，观察原子荧光强度变化情况以选择适宜KHB4浓度。

1.2.3.2 载流(HCl)浓度的选择 色谱条件与原子荧光工作条件均与1.2.3.1相同(还原剂KHB4浓度=2.0%),改变HCl溶液的体积分数(3.0%、5.0%、7.0%、9.0%、12%、15%),观察原子荧光强度变化情况,以选择适宜浓度。

1.2.4 样品前处理 称取样品0.800 g于50 mL塑料离心管中,加入10 mL 5 mol/L的HCl溶液在30 ℃水中超声90 min。将溶液进行过滤后取上清液1.0 mL,用3 mol/L的NaOH溶液调节pH使之在6.0～7.8范围内,稀释适当倍数(加入浓度为0.1% L-半胱氨酸),用0.22 μm的滤膜过滤,然后上机测定。按同一操作方法作空白实验。

1.3 数据处理

数据分析用液相色谱原子荧光光谱联用仪数据工作站进行曲线拟合(外标校正),实验中每次数据测定均重复测量三次,采用Excel软件进行数据的显著性分析,应用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择 由于使用C18反相色谱柱,流动相中需要加入有机溶剂,但高有机负荷可能导致分析时信号不稳定,实验中选用5.0%的甲醇+0.06 mol/L乙酸铵+0.1% L-半胱氨酸和5.0%的乙腈+0.06 mol/L乙酸铵+0.1% L-半胱氨酸两种流动相做对比,发现用甲醇作流动相时,柱压小于15 MPa,比较稳定,且出峰效果好,因此选用甲醇做有机溶剂参与流动相。加入少量的L-半胱氨酸来确保汞的洗脱效率,同时可以较好地消除离子型Hg的记忆效应[17]。

2.1.2 流动相pH的选择 本实验考察了流动相的pH对三种汞形态的分离度、保留时间、响应值等的影响。结果表明:pH在4.98～7.68时,对汞形态的分离度、保留时间影响不大,当流动相pH为7.01时,仪器响应值相对较高,如图1所示。因此选择实验时流动相的pH为7.01。

图1 pH对三种汞形态分离效果的影响Fig.1 The influence of pH on the separation of three mercury species注:a:pH=4.98;b:pH=7.01;c:pH=7.68。

2.1.3 流速的选择 实验通过设置不同流速,考察了流动相流量对分离效果的影响。实验结果表明,随着流速的增大,三种汞形态在色谱柱中的保留时间有所减小,而仪器的响应值变化幅度不大,将流速较低时的柱压与流速较高时的柱压进行对比分析,差异性较为显著(p<0.05,F>F crit),如图2和3所示,柱压较高不利于延长色谱柱寿命。综合考虑,实验选择0.8 mL/min作为最佳流速。

图2 流速与柱压关系Fig.2 The relationship between flow rate and column pressure

图3 流速与响应值关系Fig.3 The relationship between flow rate and response value

2.1.4 进样体积的优化 进样量主要影响仪器的响应值,如图4所示。随着进样量的增加,荧光强度也会逐渐增强,达到100 μL时,荧光强度变化明显,之后虽有增加但不明显,对分析测定来说,100 μL已经适用,过多可能会造成系统污染对结果不利。

图4 进样量对荧光强度的影响Fig.4 The influence of injection volume on fluorescence intensity

2.2 原子荧光光谱条件的优化

2.2.1 还原剂(KHB4)浓度的选择 分别配制不同浓度的KHB4溶液,观察其对原子荧光强度的影响。结果表明,当KHB4的浓度为2.0%时,汞形态能够获得较高的荧光信号,且精密度较高;浓度低于2.0%时,氢气产生量较少,单位体积内带入的样品比较少,使信号响应值偏低;浓度较高时,产生的氢气会对样品造成稀释,同样会影响荧光信号,降低仪器稳定性,还原剂浓度对荧光强度的影响如图5所示。因此,实验选用2.0%的KHB4为最佳浓度。

图5 KHB4浓度与荧光强度关系Fig.5 The relationship between the concentration of reducing agent and the fluorescence intensity

2.2.2 载流(HCl)浓度的选择 分别考察了不同浓度HCl对原子荧光强度的影响。结果表明,浓度低于7%时,不能提供足够的氢离子,不利于生成稳定的氢化物,可能会造成此反应过程的中断,对检测有较大的影响。浓度较大时,荧光强度值不稳定,甚至会降低,而当体积分数为7.0%时,三种汞形态的荧光信号响应值较大,效果较好,如图6所示。

表2 精密度结果Table 2 The precision results

图6 HCl浓度与荧光强度关系Fig.6 The relationship between HCl concentration and fluorescence intensity

2.3 汞形态分离图谱

按照1.2.2所设置的仪器条件对三种形态的汞混合标准溶液(10 ng/mL)进行分离检测,分离效果图谱如图7所示。可以看出,三种不同的汞形态在14 min内实现分离,并且分离效果十分理想,Hg2+、MeHg、EtHg的保留时间分别为4.56、6.83和12.85 min。

图7 三种汞形态的混合标准溶液(10 ng/mL)色谱图Fig.7 Chromatogram of mixed standard solution of three mercury species(10 ng/mL)

2.4 线性方程与检出限、定量限

通过实验验证,可以得知在1～100 ng/mL范围内,三种汞形态均可以呈现良好的线性关系。重新配制标准曲线(0～10 ng/mL),通过计算机软件,进入数据处理界面,先载入校准表(即标准曲线),后读进基线,由软件自动分析结果计算得出三种汞形态的检出限如表1,按照前面所述前处理方法计算得出检出限分别为0.021、0.014、0.018 mg/kg。

表1 三种汞形态的标准曲线Table 1 The standard curves of three mercury species

注:线性方程中的C表示标准溶液的质量浓度,ng/mL,I表示荧光强度;检出限按3倍信噪比计算,定量限按10倍信噪比计算。

2.5 精密度实验结果

表3 不同样品中三种Hg形态的加标回收率(ng/mL)Table 3 The recoveries of three mercury species in different samples(ng/mL)

注:N.D表示未检出。

表4 标准参考物质的汞形态分析结果(mg/kg)Table 4 Detection results of three mercury species in standard reference substance(mg/kg)

注:N.D表示未检出。由于在实际产品中不容易找到同时存在3种汞化合物的样品,所以本实验是对汞的混合标准溶液(10 ng/mL)用LC-AFS平行测定7次,利用标准曲线计算所测的浓度,以浓度和出峰面积来计算相对标准偏差(RSD),由表可知,3种汞形态都具有良好的稳定性,其RSD均小于5%。

2.6 加标回收实验结果

选取市售活龙鱼肉肠、扇贝、草鱼、龙虾、紫菜5种样品,分别向其中添加三种不同浓度梯度(分别为5、20、100 ng/mL)的三种汞混合标准溶液,LC-AFS的分析结果见表3。

由表可知,三种汞形态的加标回收率分别在80.1%～95.8%,92.1%～105%,80.3%～97.6%。由此可见,在本实验选定的实验条件下,本研究选用的仪器条件和实验方法的准确度和可靠性较高。

2.7 标准物质分析测定

用本实验建立的方法对两种鱼肉组织标准物质BCR463和 ERM-CE464进行汞化合物测定以验证本方法的准确性,结果见表4,平行样测定结果在标准范围内,两种标准物质图谱见图8及图9。由图可以看出,色谱图峰形较好,信号响应高,且不存在干扰杂峰,说明整个方法的提取和净化效果比较好。

图8 标准物质BCR463色谱图Fig.8 Chromatogram of the standard material BCR463

3 结论

本文建立了酸消解—液相色谱—原子荧光法测定水产及其制品中汞形态的方法,在14 min内实现甲基汞、乙基汞及无机汞这三种不同的汞形态的分

图9 准物质ERM-CE464色谱图Fig.9 Chromatogram of the standard material ERM-CE464

离。在色谱条件及原子荧光光谱条件优化下,选择5 mol/L HCl进行超声萃取,Athena C18色谱柱分离汞形态化合物。根据建立的方法和优化条件以鱼肉肠、扇贝、草鱼、龙虾、紫菜等5种样品为基质进行加标回收实验,回收率在80.1～105%之间,满足分析要求;以两种鱼肉组织标准物质BCR463和 ERM-CE464为研究对象验证方法的准确性,方法检出限分别为0.021、0.014、0.018 mg/kg。平行样品分析三种汞化合物的相对标准偏差(RSD)均小于5%(n=7),精密度良好。此方法前处理简单、样品提取率高,所使用设备成本较低,分离效果好,准确度高,适于水产品中汞形态的提取与定量分析要求。

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