核桃楸不同药用部位的抗氧化活性比较

赵娜娜，刘 汇，孙道磊，王 会，张 辉*，孙佳明*

（1. 黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2.吉林省延边朝鲜族自治州食品药品检验所，吉林 延吉 133002；3. 云南白药集团中药资源有限公司，昆明 650100；4.长春中医药大学，长春 130117）

核桃楸为胡桃科胡桃属植物核桃楸（ Juglans Mandshurica Maxim.），又名胡桃楸，落叶乔木，分布于中国东北、华北、河北等地区，河南、山东有散生，其种子、青果、树皮均可入药。核桃楸树皮及叶具有消热解毒抗癌作用[1-5]。用胡桃皮、胡桃枝作为抗癌民间验方，历史悠久。核桃肉还是重要的滋补中药，可治慢性阑尾炎、高血压、腰腿酸痛、止咳消肿等[6]。据报道[7-11]，核桃楸的不同药用部位中含有黄酮醇、醌、甾醇和多酚复合物等多种类型化学成分，并对清除自由基、抗病毒、抗肿瘤、抗菌杀虫等具有良好的效果。据报道[12]，核桃楸总黄酮能够有效清除DPPH自由基，具有较强的抗氧化作用。DPPH是一种比较稳定的自由基，作为一种常用筛选抗氧化药物的试剂，在国外已被广泛使用。DPPH法依据在517 nm处有最大吸收，当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，因此加入抗氧化剂后，以分光光度法测定其在517 nm处吸收值的下降值，即可看出抗氧化剂对DPPH的清除能力[13]。本文通过DPPH自由基清除模型[14]，研究核桃楸不同药用部位乙醇提取物对DPPH自由基清除活性，筛选核桃楸抗氧化有效药用部位，为其抗氧化药效物质基础研究提供科学依据。

1 材料

1.1 药材 核桃楸叶、树皮、根皮及果皮采于吉林省通化市，经长春中医药大学张辉教授鉴定为胡桃科胡桃属植物核桃楸（Juglans Mandshurica Maxim.）的树叶、树皮、根皮及果皮。

1.2 试剂与仪器 DPPH 、维生素E和维生素C（sigma公司），其余试剂均为分析纯。酶标仪（Bio-Rad）；旋转式恒温振荡器（苏州培英实验设备有限公司）；96微孔板，各型号移液枪及枪头等。

2 方法与结果

2.1 核桃楸各药用部位乙醇提取物的制备 称取核桃楸叶、树皮、根皮、果皮各10 g（40目筛）分别置于圆底烧瓶中，18倍量95%乙醇回流提取2次，1 h/次，合并提取液，过滤，减压低温浓缩至稠膏。分别取核桃楸叶、树皮、根皮、果皮乙醇提取物适量，10 mL甲醇溶解，作为供试药物。

2.2 核桃楸各药用部位乙醇提取物对DPPH自由基清除活性的测定 运用DPPH法[15-16]，对核桃楸各药用部位乙醇提取物进行体外抗氧化活性评价。精密量取浓度为26.4 mg/L的DPPH甲醇溶液 2 mL，再分别加入2 mL以甲醇为溶剂已配制好的不同浓度的样品液中，充分混匀，避光条件下反应30 min，在517 nm测定其吸光度。同时以2 mL甲醇溶液代替样品溶液作为空白对照A0，以样品溶液2 mL与2 mL甲醇溶液混合作为样品对照Aj ，并以维生素E和维生素C作为阳性对照，以样品液对DPPH溶液清除率Y可由该公式计算：Y=[1-（Ai-Aj）/A0] ×100%，其中，Ai 代表DPPH溶液与待测溶液混合后的吸光度；Aj 代表溶剂和待测溶液混合后的吸光度；A0 代表溶剂和DPPH溶液混合后的吸光度。

2.2.1 维生素C、维生素E对DPPH清除能力测定 在实验范围内，维生素C、维生素E均具有一定的清除自由基活性能力，且随着提取物浓度增加，清除率逐渐增高，但随着浓度增加到一定值后，清除率趋于平缓。维生素C在其浓度为0.816～4.080 μg/mL范围内，抗氧化剂浓度与DPPH清除率之间基本呈线性关系，经回归得方程：Y=14.792X-0.652，r2= 0.997 1，其中：Y为DPPH清除率，X为维生素C的浓度。维生素E在其浓度为2.944～14.720 μg/mL范围内，抗氧化剂浓度与DPPH清除率之间基本呈线性关系，经回归得方程：Y = 4.0452X-3.157，r2= 0.998 9，其中：Y为DPPH清除率，X为维生素E的浓度。

2.2.2 核桃楸叶、树皮、根皮、果皮对DPPH清除能力测定 在实验测定的范围内，核桃楸叶各萃取部位均具有一定的清除自由基活性的能力，且随着提取物浓度增加，清除率逐渐增高，但随着浓度增加到一定值后，清除率趋于平缓。核桃楸叶其浓度在6.080～18.231 μg/mL范围内，抗氧化剂浓度与DPPH清除率之间基本呈线性关系，经回归得方程：Y = 2.831 8X-0.005 9，r2= 0.999 7，其中：Y为DPPH清除率，X为抗氧化剂质量浓度；树皮其浓度在0.890～7.150 μg/mL范围内，抗氧化剂浓度与DPPH清除率之间基本呈线性关系，经回归得方程：Y = 5.887 1X-2.656 8，r2= 0.998 7，其中：Y为DPPH清除率，X为抗氧化剂质量浓度；根皮浓度在1.110～8.862 μg/mL范围内，抗氧化剂浓度与DPPH清除率之间基本呈线性关系，经回归得方程：Y = 5.471X-6.488，r2= 0.999，其中：Y为DPPH清除率，X为抗氧化剂质量浓度；果皮浓度在9.110～27.320 μg/mL范围内，抗氧化剂浓度与DPPH清除率之间基本呈线性关系，经回归得方程：Y = 1.762 1 X+2.065 4，r2= 0.997 4，其中：Y为DPPH清除率，X为抗氧化剂质量浓度。

核桃楸各药用部位乙醇提取物的DPPH清除率见表1，结果可见，核桃楸树皮、根皮活性对DPPH自由基清除活性均较好，且抑制率强于维生素E而弱于维生素C，而核桃楸叶、核桃楸果皮活性稍弱，表明核桃楸树皮、根皮系抗氧化有效药用部位。

表1 核桃楸各药用部位乙醇提取物的DPPH自由基清除活性

3 讨论

本实验结果显示，核桃楸树皮、根皮清除DPPH自由基的IC50均低于10 μg/mL，二者活性强于维生素E而弱于维生素C，说明二者具有很强的抗氧化活性，为核桃楸抗氧化的有效药用部位。但如果针对核桃楸树皮及根皮开发应用将严重影响生态破坏及资源的可持续利用。而核桃楸叶也具有较好的抗氧化活性，富含丰富的黄酮类成分。而黄酮类成分不仅通过自身具有的酚羟基而发挥自由基清除作用[17]，而且还具有其他多种生物活性。不同类型的黄酮类成分通过抑制α-葡萄糖苷酶而发挥降血糖作用；抗辐射的作用机制与其对造血系统和免疫系统的保护、对活性氧自由基的清除和对脂质过氧化的抑制以及对DNA损伤的防护等作用有关；通过抑制神经氨酸酶发挥抗病毒活性，通过降血脂、降压及抗氧化等药理作用，有利于促进心脑血管疾病的康复；通过调控神经内分泌免疫网络功能而抗焦虑[18-22]。尤其是在抗肿瘤方面，黄酮类成分也体现出独特的活性，这从另一方面阐明了核桃楸不同药用部位具有的抗肿瘤活性不仅源于树皮、果皮中的胡桃醌及其衍生物，而且也源于核桃楸叶中富含的黄酮类成分[23-24]。同时核桃楸叶是一种可持续再生资源，可以为天然抗氧化剂的新来源，并有潜力针对多种疾病进行深度开发。因此，核桃楸叶能够作为核桃楸新的药用部位，在新的应用方向上进行可持续利用研究。

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