猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2研究进展

赵 军，徐志文，2，朱 玲，2，*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.四川农业大学 动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)

PRRSV是单股正链RNA病毒，属尼多病毒目动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。其基因组全长约15.4 kb，包含10个ORFs，分别为ORF1a、1b、2a、2b以及ORF3- 5、ORF5a、ORF6- 7。ORF1a在病毒复制中，先被翻译成ppla多聚蛋白，ORF1b通过核糖体转移码转移成pplab多聚蛋白。之后分别被水解为Nsp1- 8和Nsp9- 12等至少16种非结构蛋白[1-3]。PRRSV感染早期Nsp1β、Nsp2、Nsp4、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8定位于细胞核周围，原位标记显示它们共定位的位置为病毒RNA复制场所[4]。

Nsp2基因是PRRSV遗传流行病学监测和演化的重要基因，当前PRRSV多亚型毒株在Nsp2基因区段均有不同程度的基因插入和缺失。所以关于Nsp2蛋白与PRRSV毒力、致病性的关系、对细胞的侵袭能力的研究越来越多，也越来越深入。Nsp2是PRRSV最大的复制蛋白，其基因长度约为2.9 kb，不同毒株序列之间变异明显且基因全长不一。Nsp2保守性最差，美洲型毒株和欧洲型毒株序列比对显示，氨基酸序列同源性仅为32%，抗原表位众多，而表位集中区域容易发生基因变异。

目前已鉴定Nsp2有4个主要功能区：N端的半胱氨酸蛋白酶结构域(PL2)；功能尚未清楚的中间高变区；近C端的高亲水性跨膜区；功能尚不明确的C端富含半胱氨酸残基保守区。Nsp2蛋白具有顺式和反式2种酶切活性，所以酶切后能够产生7种Nsp2亚型(Nsp2a、Nsp2b、Nsp2c、Nsp2d、Nsp2e、Nsp2f、Nsp2TF)。其中Nsp2TF是最近发现的能影响PRRSV复制的新亚型(约占Nsp2的2/3)。这些Nsp2使用相同的N末端和不同的C末端[3,5]。Nsp2是一个与病毒相关的PRRSV蛋白，研究表明PRRSV的复制过程中会出现大小不一的Nsp2亚类，它们共享PL2区域的227个氨基酸的N端。产生的这些不同分子量的Nsp2可能存在不同的功能，大分子Nsp2亚型蛋白在感染早期出现，对病毒的早期复制可能发挥着关键作用[6-7]。Nsp2以多个亚型存在于病毒包膜上，在病毒包装时与病毒的包膜融合有关，还存在于细胞突起上，与细胞之间的联系密切相关，其所诱导的体液免疫所产生的抗体与结构蛋白N蛋白形成的免疫水平相当。其N末端具有保守的催化N末端半胱氨酸和组氨酸残基的活性，并被认为具有半胱氨酸蛋白酶的活性[8]。此外，Nsp2还是Nsp4丝氨酸蛋白酶的辅助因子，与细胞和组织嗜性有关，在病毒复制过程中，参与多聚蛋白的装配[9]。

当前，PRRS对养猪业造成的冲击正逐渐加重，特别是2013年以后国内多地相继报道发现Nsp2缺失131aa的NADC30类似毒株，使得国内PRRSV的防控变得更加复杂。Nsp2是不同亚型毒株之间变异最明显也最没有规律的蛋白，当前对地区PRRSV的流行病学调查及毒株遗传进化分析多以Nsp2基因为靶基因。现有的研究结果表明，当前NADC30类似毒株多发现于河北、河南、山东、辽宁等省，南方地区还未见报道，但基于当前交通便利、生猪流动大等现状，NADC30类似毒株何时能传入南方，能造成多大困扰还未可知。因此，针对新流行毒株的检测及其变异后的Nsp2在病毒复制、致病力和参与免疫调控方面的研究是很有必要的。

1 Nsp2的高变异性

Nsp2在非结构蛋白中变异性最大，点突变、插入和缺失是PRRSV Nsp2的常见突变。对中国的PRRSV进行调查分析，Nsp2基因具有广泛的变异性[10]。2006年，我国爆发了高致病性PRRS(HP- PRRS)，2008年，美国报道发现一种新亚型的HP- PRRSV(NADC30)，通过Nsp2的基因序列比较结果显示，HP- PRRSV和经典PRRSV比较在Nsp2高变区存在30 aa左右的连续缺失[11]，而NADC30类型毒株较HP- PRRSV在Nsp2高变区存在131 aa左右的不连续缺失[12-14]，从GenBank中收录的HP- PRRSV、经典PRRSV、NADC30类型毒株遗传进化树分析显示，NADC30毒株与国内主流毒株HP- PRRSV、经典PRRSV分属2个大的分支，而HP- PRRSV、经典PRRSV属于同一进化分支(图1)。

野毒株自然缺失时有报道：本实验室毛汐语等[15]2012年分离的SC2012自然减毒株，在aa485～aa498区间连续缺失14个氨基酸；Gao等[16]首次报导了PRRSV Nsp2天然缺失的病毒株HB- 2(SH)/2002，在aa471～aa482区间连续缺失12个氨基酸；Liu等[17]分离的2株欧洲型PRRSV在Nsp2的aa282～aa348区间连续缺失68个氨基酸，同时还分离出4株北美型PRRSV在aa322～aa432、aa483、aa504～aa522区间连续缺失31个氨基酸[18]；Ji等[19]分离的GZgy15- 1毒株在Nsp2的aa488～aa516区间缺失29个氨基酸。另外还发现，在FJLYDX04株的aa599～aa603序列中有5个碱基的插入，这是中国第一株报道Nsp2存在插入的病毒株[20]。此外，病毒株HZ- 31的Nsp2区含有59个不连续缺失，分别为aa467～aa474、aa498～aa519和aa533～aa361，但它的481位未像其他HP- PRRSV株一样缺失，在遗传系统中分析，它是独立于JXA1和EM2007的一个单独分支[21]。

表1分离株Nsp2变异情况

Table1Nsp2 variation of isolated strains

毒株Strain分离年限Isolationtime分离国家Isolationcountry氨基酸缺失(插入)Aminoaciddeletion(insertion)突变位点Positionrelativetocomparedstrain参考毒株ReferencePRRSVstrain基因类型Genotype登录号AccessionNo.HB-2(SH)/20022002China12aa471～482VR-2332NorthAmerican-JXA12006China1aa,29aa483,504～522VR-2332NorthAmericanEF112445GDQY22007China35aa,29aa470～505,532～560VR-2332NorthAmericanGU454850Em20072007China68aa499～566VR-2332NorthAmericanEU262603SC20122012China14aa485～498JXA1NorthAmericanKM189443NADC302011China131aa—JXA1NorthAmericanJN654459HENAN-XINX2013China131aa303,323～433,501～519JXA1NorthAmericanKF611905HZ-312013China8aa,22aa,29aa467～474,498～519,533～561JXA1NorthAmericanKC445138GZgy15-12015China29aa488～516JXA1NorthAmericanKT358728CHsx14012015China111aa323～433JXA1NorthAmericanKP86162515LY02-FJ2015China11aa322～432,483,504～522JXA1NorthAmericanKU215417HNhx2016China111aa,1aa,19aa323～433,483,501～519JXA1NorthAmericanKX766379FJQEU142014China68aa282～348LVEuropeanKP860913

图1 不同基因类型遗传进化分析Fig.1 Genetic evolution analysis of different gene types

2 Nsp2与PRRSV毒力

从经典PRRSV、HP- PRRSV和NADC30类PRRSV的Nsp2变异的情况分析，研究人员们一直怀疑Nsp2的氨基酸缺失导致了HP- PRRSV毒力的增强，但是现已通过多个强、弱毒株基因片段置换试验证明其与毒力并无关联。Zhou等[22]在HP- PRRSV反向遗传操作平台的基础上通过分别置换强毒株JXwn6和弱毒株HB- 1/3.9的相对应的Nsp2区域，然后恢复病毒测定病毒的致病力，动物实验结果表明，互相置换了Nsp2相应区域的恢复毒株与亲本株的致病力无异。

Li等[23]在HP- PRRSV反向遗传操作平台的基础上通过分别置换强毒株JXwn6和弱毒株HB- 1/3.9的5’UTR+ORF1a和ORF1b以及M和N蛋白，然后恢复病毒测定病毒致病力，结果表明置换ORF1a的恢复病毒不管是强毒株还是弱毒株，毒力没有相应减弱或增强。这2个试验充分表明HP- PRRSV的Nsp2连续缺失30 aa并不是其毒力增强的主要原因。

3 Nsp2与PRRSV复制

病毒的复制有时需要利用宿主蛋白，但是自身的一些非结构蛋白也会参与病毒的复制过程。PRRSV是正链RNA病毒，复制过程在细胞质靠近细胞核的双层囊泡中进行，而对Nsp2的亚细胞定位结果显示其定位于细胞核周围，与双层囊泡的位置相一致，是病毒复制和转录的关键区域[24]。王凤雪等[25]通过将HP- PRRSV弱毒株TJM株的Nsp2稳定转染到Marc- 145细胞中，建立了稳定表达Nsp2蛋白的细胞系，通过接种病毒测定病毒含量发现Nsp2蛋白能够促进PRRSV的增殖。在对Nsp2影响PRRSV复制的深入研究中发现，Nsp2的aa323～aa433和aa628～aa747虽不是PRRSV复制的关键位点，但在PRRSV复制过程中起到了重要的作用[26]。进一步通过截断蛋白瞬时表达的方式探索Nsp2中缺失的氨基酸与PRRSV复制是否有关，发现TJM株Nsp2中缺失的120 aa中的aa628～aa727能够抑制病毒的增殖[27]。在对Nsp2的N端的半胱氨酸蛋白酶结构域(PL2)和功能尚不明确的C端富含半胱氨酸残基保守区病毒复制的影响的试验研究发现，在C末端插入EGFP蛋白并不能对病毒的复制造成影响，EGFP蛋白能正常表达，但是对N端的研究表明，PL2的反向切割活性在病毒复制过程中是非常重要的。进一步对其精确的位点的研究发现，PL2的核心域(aa47～aa180)和直接下游区域(aa181～aa323)是病毒复制必不可少的[28-29]。

除Nsp2直接影响病毒的复制以外，还存在其他途径影响病毒增殖，细胞中的一些蛋白质也能通过与Nsp2互作来影响PRRSV的复制，Nsp2招募Bcl2相关抗凋亡基因6(BAG6)蛋白并利用该蛋白帮助NSP2定位于内质网促进双层膜泡的形成[30]。细胞中的14- 3- 3蛋白家族是常见的蛋白家族，通过激光共聚焦和过表达最终确定14- 3- 3蛋白能够作用Nsp2促进PRRSV的增殖[31]。Nsp2利用N端的半胱氨酸蛋白酶的去泛素化酶活性抑制凋亡诱导分子1(AIF1)的泛素化降解，从而促进PRRSV复制过程中胞内ATP的合成[32]。同时也有研究表明病毒复制过程中自身产生的miRNA(微小核糖核酸)能够直接靶向Nsp2基因来抑制病毒的增殖，形成负调控[33]。

总之，通过由简到繁、由全蛋白到关键位点的对Nsp2影响、参与病毒复制的研究表明，Nsp2的高变区域依旧有一些关键位点能够影响病毒的复制，其N- 末端和C- 末端的一部分区域在病毒复制过程中是至关重要的。

4 Nsp2与免疫调控

Nsp2蛋白是病毒蛋白中最大的蛋白，它参与多肽的组合和病毒的复制等复杂的过程，并富含抗原表位[34]。近年来，关于PRRSV对猪免疫抑制的报道主要集中在对各种细胞因子的抑制及促进方面，以间接反映宿主免疫反应情况。Beura等[35]发现，PRRSV的4个非结构蛋白对IFN- β启动子(IRF- 3)的活性起到有效的抑制作用。依据它们的影响大小，排序为Nsp1、Nsp2、Nsp11和Nsp4。Li等[36]证明，Nsp2通过抵抗IFN调节因子3(IRF- 3)的活性进而强烈地抑制由仙台病毒诱导的IFN- β产生。有研究显示，Nsp2蛋白在PRRSV感染细胞的胞质内分布，并与RIG- I信号通路中的一个衔接分子MAVS和能够激活细胞内I型IFN信号通路的信号分子LSml4A共定位，但不影响IRF- 3或NF- κB入核，表明PRRSV对先天免疫的影响可能在细胞核内[6]。Sun等[37]证明，Nsp2的卵巢肿瘤蛋白酶(OTU)区域具有泛素连接酶活性，这个区域可以通过对IκBα聚泛素化而抑制IκBα的降解，而IκBα是NF- κB的抑制因子，从而抑制NF- κB的活性而抑制IFN- I的产生。而Fang等[38]证明，PRRSV WUH3株Nsp2蛋白的过量表达能够诱导IκBα降解，激活NF- κB。并且确定了Nsp2的高变区(aa179～aa782)对于激活NF- κB是不可缺少的，并且它所刺激的活性与Nsp2全长基本一致。非结构蛋白还可以诱导产生IFN- γ和IL- 10。Burgara- Estrella等[39]通过动物试验确定PRRSV Nsp2的非保守多肽(589SLYKLLLEV597)可以引起猪的免疫反应，并产生IFN- γ。Xing等[26]通过缺失多株PRRSV Nsp2高变区的片段研究其对机体免疫诱导的影响，发现缺失aa322～aa434、aa531～aa561和aa531～aa561、aa627～aa748的恢复毒株诱导IL- 1β、IL- 6和TNF- α的能力降低，但aa531～aa561、aa627～aa748缺失株却能强烈诱导IL- 12(P40)的表达。

5 Nsp2的可插入位点与分子标签

Nsp2的非必需区域能够插入表达外源蛋白，目前关于对Nsp2插入外源蛋白的位点和外源蛋白的种类做了很多的研究。同时由于Nsp2的高突变导致其不同亚型之间插入和缺失突变非常严重，能够利用其毒株之间的插入和缺失来区分毒株亚型，同样也起到分子标签的作用[40]。

Kim等[41]通过在Nsp2非关键区进行缺失并插入肽标签，发现拯救病毒株毒力显著降低，并能被特异抗原包被的ELISA试剂盒检测，再次验证了Nsp2是用来发展标记疫苗和弱毒苗的潜在靶基因。Xu等[42]在对疫苗毒HuN4- F112 Nsp2复制非关键区缺失25个氨基酸，并插入新城疫病毒N蛋白免疫显性B细胞表位49个氨基酸作为一种基因标记疫苗，在动物体内能同时产生对抗NDV NP及PRRSV的特异性抗体，而且缺乏针对缺失的25个氨基酸的抗体，免疫猪获得很好的免疫保护，该疫苗可以作为一种有效的对抗PRRSV的基因标记苗。

Yu等[43]利用反向遗传操作平台将猪的粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GM- CSF)插入到HuN- F112的ORF1b与ORF2a之间作为分子标记，后续试验表明GM- CSF能够稳定地随着病毒复制而表达，说明在这一区域能够允许外源蛋白的插入。

6 展望

随着对PRRSV Nsp2蛋白的深入研究，Nsp2在病毒复制、致病性、机体相互作用方面的作用也越来越清晰。Nsp2基因在不同亚型中的特征性变异，为PRRSV变异亚型的鉴定提供依据，同时，这些研究也揭示了Nsp2氨基酸的变异不是PRRSV的毒力改变的主要因素，但是Nsp2蛋白在PRRSV的复制、免疫调控等方面扮演着重要的角色。Nsp2 能够直接影响病毒的复制，并且Nsp2也能通过与细胞中的一些蛋白质互作来影响PRRSV的复制。Nsp2对IFN- β启动子(IRF- 3)的活性起到有效的抑制作用，从而抑制病毒诱导宿主产生IFN- β。Nsp2的卵巢肿瘤蛋白酶(OUT)区域可以通过对IκBα聚泛素化而抑制IκBα的降解，从而抑制NF- κB的活性而抑制IFN- I的产生。Nsp2的高变区(aa179～aa782)对于激活NF- κB是不可缺少的。同时，Nsp2非必需区域的高变性为PRRSV作为载体插入外源蛋白和分子标签提供了可能。对Nsp2蛋白的功能研究有助于阐明PRRSV非结构蛋白参与免疫调控网络，同时Nsp2蛋白的遗传变异研究有助于相关重组疫苗的研究和分子标签的应用，为疫苗株和野毒株的鉴定提供参照。

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