酿酒酵母胞内物质提取工艺优化

2018-03-02 18:42王周利高振鹏
农产品加工 2018年4期
关键词:离子流水溶液酿酒

尚 磊,王周利,高振鹏

(1.宝鸡市特种设备检验所,陕西宝鸡 721000;2.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100)

酿酒酵母广泛应用于生活中,在食品生产中也得到了广泛的利用,如馒头的发酵、面包的生产、酱油的生产等,不仅在食品生产中得到了应用,在工业生产中也得到了广泛应用,包括工业生产乙醇、生产单细胞蛋白等方面[1-5]。对酿酒酵母胞内物质提取工艺进行优化,利用有机试剂提取,对胞内物质淬灭、提取条件进行优化,旨在为提高酿酒酵母胞内物质提取的利用率提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株、试验试剂

酿酒酵母,由实验室提供。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉,以上均为分析纯,北京奥博星生物技术有限责任公司提供;甲醇,色谱纯,天津科密欧化学试剂开发中心提供;高氯酸、乙醇,分析纯,天津市化学试剂一厂提供。

1.2 主要仪器与设备

灭菌锅,上海申安医疗器械厂产品;离心机,美国Labconco公司产品;水浴锅,上海司乐仪器厂产品;分光光度计,上海精密科学仪器有限公司产品;气相色谱-质谱联用仪,日本岛津公司产品。

1.3 培养基及试剂的配制

(1) 培养基的配制。菌株的培养采用YPD培养基;将配制好后于120℃条件下灭菌20 min,待用。

(2)试剂的配制。40%,60%,80%甲醇淬灭试剂;高氯酸提取试剂、沸乙醇提取试剂、纯甲醇提取试剂。

2 试验方法

2.1 菌株的活化

将冻存的甘油管的酿酒酵母用YPD培养基活化,完成第2次活化后待用[6-8]。

2.2 生长曲线的测定

将活化好的菌种以2%的比例用移液枪接种到已灭菌的培养基中,于28℃条件下发酵培养,分别培养至 0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,24 h后取样,利用分光光度计测定OD值。每次调零时均用未接种的培养基调零,以减小误差,并记录数据。

2.3 样品的淬灭

采用3种淬灭试剂淬灭,即40%,60%,80%甲醇淬灭试剂。取对数期的菌液5 mL加入预冷的淬灭试剂中,于-20℃条件下淬灭30 min,然后以转速10 000 r/min离心5 min,然后用相同的淬灭试剂清洗2次,离心得到的沉淀用提取试剂提取[9-13]。

2.4 样品提取

样品经过淬灭后,采用高氯酸提取法、冷甲醇反复冻融、沸乙醇提取3种方法提取。

(1) 用5 mL 10%(V/V) 高氯酸重悬酵母菌体,放入液氮中,然后在冰浴上解冻,反复3次。离心、吸取上清液,用10 mol/L的KOH溶液中和至pH值为7;离心、去沉淀,吸取上清液冷冻干燥。

(2) 2 mL的纯甲醇悬浮淬灭的酵母泥,在液氮中反复冻融3次,离心吸取上清液,再次用纯甲醇清洗,涡旋振荡30 s,合并2次上清液,冷冻干燥。

(3)5 mL沸乙醇溶液重悬淬灭后的酵母菌体。于90℃水浴中保温3 min,随后立即放入冰浴冷却3 min;离心后吸取上清液,冷冻干燥。

2.5 硅烷化衍生

酵母细胞经过淬灭提取、冷冻干燥得到的粉末,由于较多的代谢物含有极性官能团,并且其具有不稳定性和不挥发性,在上机测定前需要硅烷化衍生,从而有利于代谢物分子结构的确定。根据需要,以吡啶作为溶剂,乙氧基胺作为污化试剂,MSTFA作为硅烷化试剂,进行衍生反应,污化衍生90 min,硅烷化衍生30 min,衍生温度40℃。

2.6 气相色谱-质谱条件

(1)色谱柱。DB-17MS毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);采用自动进样,进样口温度300℃,载气为He(纯度99.99%),不分流进样,流量1 mL/min,进样体积1 μL。

(2) 程序升温。起始温度为100℃,保持2 min,以5℃/min的速度升温至200℃,再以10℃/min的速度升温至300℃,保持3 min。

(3)质谱条件。电子轰击电离(EI),电子能量70 eV,离子源温度250℃,接口温度280℃,质量扫描范围 50~500 m/z。

3 结果与分析

3.1 生长曲线的测定

对酵母细胞内的物质提取检测,各个时期不一样,一般选取微生物生长相对稳定的状态,选取对数后期或者稳定期可以可靠反应微生物的代谢情况。

酿酒酵母生长曲线见图1。

图1 酿酒酵母生长曲线

由图1可以看出,酿酒酵母生长速度较快,从适应期开始进入稳定期仅仅用了将近10 h的时间,在2~8 h,酿酒酵母处于对数期,此时期酵母快速生长,在10 h之后趋于稳定,为了提取酿酒酵母的胞内物质,根据图1选择12 h取样,12 h后基本趋于稳定,方便下一步研究。

3.2 代谢组淬灭的优化

对不同的方法淬灭,文献已有报道,根据试验需要,采用不同体积分数的甲醇水溶液进行淬灭,经过40%,60%,80%的甲醇水溶液淬灭后,采用冷甲醇-反复冻融提取的方法,采用GC-MS进行评价。

40%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱见图2,60%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱见图3,80%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱见图4。

图2 40%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱

图3 60%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱

选用不同体积分数的甲醇水溶液(40%,60%,80%)对稳定期的酿酒酵母淬灭,在硅烷化衍生后采用气相色谱-质谱联用对其效果评估,从提取的数量上来看,60%的甲醇水溶液淬灭效果最好,提取物质最多,达到82种,分别由40%,60%,80%的甲醇水溶液作淬灭试剂,纯冷甲醇为提取试剂,采用GC-MS评价其效果,3种得到的代谢物数量分别为61,78,51 种。

图4 80%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱

不同体积分数淬灭试剂提取的物质种类见表1。

表1 不同体积分数淬灭试剂提取的物质种类/个

由表1可以看出,不同的物质种类数量组成,60%的甲醇水溶液淬灭效果最好,所以选择此试剂作为最优淬灭试剂。

3.3 不同提取试剂的优化

上述试验确定了60%的甲醇水溶液作为最优淬灭试剂,此试验采用高氯酸、纯甲醇、沸乙醇作为提取试剂,以此来提取酿酒酵母胞内物质,并采用GC-MS对其进行评价,并对检测到的物质进行归类汇总。

不同提取方法代谢物见表2。

表2 不同提取方法代谢物/个

由表2可以看出,3种提取试剂中高氯酸提取效果最差,纯甲醇和沸乙醇效果较好,纯甲醇的提取物质达到83种,效果最好,甲醇具有一定的极性,沸乙醇提取的效果仅次于纯甲醇的效果,由于实际操作中,沸乙醇具有挥发性,对于提取的物质的定量计算有一定的影响,因此选择纯甲醇作为提取试剂。

4 结论

通过比较酵母胞内物质淬灭与提取的方法,不同体积分数的甲醇水溶液作为淬灭试剂,然而在60%体积分数下,淬灭效果最佳。在3种提取试剂中,沸乙醇和冷甲醇效果较好,但根据实际需要,选用效果最好的冷甲醇作为提取试剂,以利下一步的研究。

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