离子色谱法测定婴幼儿米粉中硝酸盐和亚硝酸盐

郑小玲，郭小喜，李晓华，张舸，胡鑫，邹琼

（1.重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，重庆600020；2.山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山西太原030024）

随着人们生活水平的提高，婴幼儿米粉的品种及需求量日益增大，而婴幼儿体质较差，肠道微生物还原作用较强，易发生肠原性青紫病，即亚硝酸盐中毒。硝酸盐和亚硝酸盐对婴幼儿的危害远大于成人[1-4]。在GB 10769-2010《食品安全国家标准婴幼儿谷类辅助食品》[5]中规定婴幼儿米粉中硝酸盐（以硝酸钠计）残留量限量为100 mg/kg，亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）残留量限量为2 mg/kg。鉴于在婴幼儿米粉中硝酸盐和亚硝酸盐的限量较低，且对婴幼儿的危害较大，建立灵敏度高和准确性好的方法，有利于企业在生产过程对于婴幼儿米粉的质量控制和市场产品监管检测。

在实际工作中，由于婴幼儿米粉的特殊性，基质成分相对复杂，样品中含有淀粉，极易糊化。GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[6]适用于食品中硝酸盐和亚硝酸盐的测定，涉及食品种类广泛，但是对于米粉基质并不适用。按GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》的前处理方法在实际操作中遇到前处理液粘稠不宜过滤，并且过滤后滤液浑浊，滤液过固相萃取小柱非常困难等问题。查阅文献资料，只有采用比色法测定米粉中亚硝酸盐的研究[2，4]，比色法灵敏度及重复性较差，暂无米粉中硝酸盐测定的研究。本方法优化了国标中的前处理方法，结合在线过滤技术净化样品，解决上述问题，实现对婴幼儿米粉中硝酸盐和亚硝酸盐的定性定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丙酮（色谱纯）、Ag柱（1 mL）、Na柱（1 mL）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；冰醋酸（色谱纯）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；碳酸钠（基准试剂）：北京化学工业集团有限责任公司；硝酸钠标液（1 000 mg/L）、亚硝酸钠标液（1 000 mg/L）：美国阿酷标品公司；水为GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水；C18小柱：美国色谱科公司，3 mL/500 mg；10 mL注射器：岳阳明康医用材料有限公司；0.22 μm水性滤膜：天津津腾实验设备有限公司；市售婴幼儿配方米粉和跨境电商平台抽检婴幼儿配方米粉各50份。

1.2 仪器与设备

离子色谱940：瑞士万通中国有限公司；MX-F冷冻高速离心机：德国西格玛公司；BS224S电子天平：德国赛多利斯斯泰帝（上海）贸易有限公司；KQ-500E超声仪：昆山舒美公司；Milli-Q超纯水系统：德国默克密理博公司。

1.3 试验过程

称取均匀试样4 g，置于50 mL离心管中，准确加40 mL超纯水，摇匀，超声30 min，取出放置室温，加入3%乙酸溶液2 mL，混匀。于4℃放置20 min，取出离心 10 000 r/min，15 min。取上清液约 15 mL，C18柱、Ag柱和Na柱，弃去前面7 mL，收集后面洗脱液，通过0.22 μm水性滤膜针头过滤器，进样测试。固相萃取小柱使用前需活化，C18依次用10 mL甲醇和10 mL超纯水通过，静置活化30 min。Ag柱和Na柱用10 mL超纯水通过，静置活化30 min。

1.4 色谱条件

阴离子色谱分析柱为Metrosep A7-250（250 mm×4 mm）；保护柱 MetrosepASupp4/5Guard（5mm×4mm）；柱温 45 ℃；进样体积 100 μL，流速为 0.7 mL/min；淋洗液2.5 mmol/L NaCO3+5%丙酮。

1.5 标准溶液配置

准确移取亚硝酸根离子（以NO2-计）标准溶液1 mL和硝酸根离子（以NO3-计）标准溶液10 mL于1 000 mL容量瓶中，用水稀释定容，亚硝酸根离子浓度为 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/L，硝酸根离子浓度为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/L。以浓度对峰面积做曲线，计算相关系数。试样加标后，平行测定6次，计算结果相对标准偏差和方法回收率。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化

2.1.1 称样量的选择

由于婴幼儿米粉中添加了多种营养物质，基质复杂，干扰较多，选择合适的称量样对试验有一定影响。由于实验室过程中前处理只是简单沉淀蛋白质，除去大分子物质，主要还得通过色谱柱分离目标物。如果称样量较大，样品糊化极为严重，杂质干扰目标峰。如果称样量较小，则达不到检测要求的灵敏度。研究考察了 0.5、1.0、2、4、6、8 g 这 6 个称样量，对比不同称样量样品的色谱图，参考峰形、分离度、灵敏度和基线，结果显示称样量4 g效果最佳。

2.1.2 沉淀剂的选择

通常采用有机溶剂、酸沉淀、加热变性和重金属沉淀等方法去除蛋白质。由于婴幼儿米粉样品基质复杂，采用有机溶剂容易在过C18小柱时将杂质物质洗脱。采用加热变性法不适用于米粉，因为米粉极易糊化，且沉淀效果较差。采用重金属沉淀，如常用的乙酸锌、亚铁氰化钾沉淀蛋白质，会引入大量锌、钾、铁离子污染色谱柱，降低离子色谱柱效，影响色谱柱寿命。试验表明，采用3%的乙酸沉淀蛋白质效果最佳，杂峰相对较少。

2.1.3 样液分离及初步净化

本方法采用50 mL离心管进行沉淀，比国标方法中采用100 mL容量瓶简易，方便批量操作。由于米粉含有淀粉，容易糊化，采用滤纸过滤的方法根本不适用，本方法采用低温离心分离样液。上清液依次过C18柱、Ag柱和Na柱净化。由于样品中氯离子含量较高，使用Ag柱出去氯离子，避免过量的氯离子干扰亚硝酸根的测定。

2.1.4 在线超滤

婴幼儿米粉基体复杂，成分复杂，除含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质外，还添加了多种食品添加剂。过固相萃取小柱后的样液仍不太澄清，稍浑浊。但离子色谱所分析的样液要求严格，样品不得含有颗粒物，因为这些颗粒将堵塞并最终损坏分离柱。本方法采用英兰超滤技术，即在进样口前加一个0.22 μm的在线英兰超滤系统，可以直接处理悬浊液的样品。该技术将大分子物质、大颗粒物质转移，防止其损坏分离柱，堵塞管路。该法采用在线英兰超滤技术有效保护分离柱，并减小干扰，操作简单。

2.2 仪器条件的优化

2.2.1 淋洗液的选择

淋洗液的浓度对阴离子的分离影响较大，试验比较了Na2CO3和NaHCO3不同浓度的淋洗液。参考文献的几种淋洗浓度[7-12]，分别用2.5 mmol/L NaCO3-0.5 mmol/L NaHCO3、3.0 mmol/L NaCO3-0.8 mmol/L NaHCO3、3.2 mmol/L NaCO3-1.0 mmol/L NaHCO3、2.0 mmol/L NaCO3-5%丙酮、2.5 mmol/L NaCO3-5%丙酮、3.0 mmol/L NaCO3-5%丙酮做淋洗液。检测同一标准溶液，结果表明在2.5 mmol/L NaCO3-5%丙酮条件下背景电导率较小，硝酸盐和亚硝酸盐的分离效果最好。该法向淋洗液中加入适量丙酮，可有效改善分离效果，与杂质峰完全分离。灵敏度高，分析时间符合要求。故本文选用2.5 mmol/L NaCO3-5%丙酮做淋洗液，待测组分可完全分离，如图1~图4所示。

该法在沉淀蛋白质时引入了乙酸，亚硝酸根和硝酸根离子与其完全分离，不影响检测结果。婴幼儿米粉基质组成复杂，亚硝酸根和硝酸根离子洗脱后还需要高浓度的40 mmol/L NaCO3-5%丙酮清洗色谱柱。

2.2.2 进样量的选择

图1 亚硝酸盐和硝酸盐的标准溶液离子色谱分析谱图Fig.1 The ion chromatogrephy chromatogram of NO2-and NO3-standard sample

图2 空白试剂色谱图Fig.2 Blank reagent chromatogram

图3 米粉样品色谱图Fig.3 Baby rice flour sample chromatogram

图4 米粉样加标色谱图Fig.4 Baby rice flour spiked sample chromatogram

由于样品中硝酸盐和亚硝酸盐的含量通常是痕量的，亚硝酸盐含量限量为2 mg/kg，对于仪器的灵敏度要求较高。样品的进样量对于色谱的分离有一定的影响。加大进样量可以提高样品的灵敏度。但是样品进样量过大又会造成色谱柱过载，杂质峰和溶剂峰过大，影响待测物质的分离效果。考察了25、50、100、200、500 μL这 5种进样量，从分离效果、峰形、峰面积、基线等方面比对，考察色谱图，发现在100 μL的进样量时，色谱峰峰形较好，对称性较好，灵敏度高，基线平稳，噪音小。

2.3 线性范围

按1.4所述试验方法配置硝酸根和亚硝酸根离子的混合标液。按色谱条件对混合标液进行测定。当硝酸根离子浓度为0.1 mg/L~2.0 mg/L，亚硝酸根离子浓度为0.01 mg/L~0.20 mg/L时，浓度与峰面积呈良好的线性关系。以峰面积A（μS×min）对检测组分质量浓度Q（mg/L）作线性回归，标准曲线方程和相关系数（R）如表1所示。

2.4 最低检出限

以基线噪声的3倍所相当的标准物质浓度计算，本法测定硝酸盐（以NO3-计）最低检出浓度为0.2mg/kg，亚硝酸盐（以NO2-计）最低检出浓度为0.1 mg/kg，低于国家标准方法的最低检出浓度。

表1 标准曲线方程和相关系数Table 1 Linear equation and correlation coefficient

2.5 方法重现性及回收率

国内外现暂无米粉中硝酸盐和亚硝酸盐的基准物质。本方法选择3个添加水平进行试样加标回收率试验，以此方法平行测定6次，对测定结果的重现性，进行统计学处理。6次测定结果相对标准偏差（RSD）和平均回收率结果见表2。

表2 样品加标回收率（n=6）Table 2 Recovery rate of standard additions（n=6）

续表2 样品加标回收率（n=6）Continue table 2 Recovery rate of standard additions（n=6）

相对标准偏差为1.2%~2.4%，小于5%，回收率结果在90.0%~96.0%之间。试验证明，本方法的准确度和精密度达到定量分析要求。

2.6 常见阴离子的干扰

在本试验色谱条件下，常见阴离子F-、Cl-、SO42-的保留时间分别为6.2、8.7、23.1 min。这几种离子均不干扰硝酸盐和亚硝酸盐的测定。蛋白沉淀剂引入的乙酸也与硝酸根和亚硝酸根离子完全分开。

2.7 实际样品的测定及回收率

对重庆市市售和跨境电商的50份的不同品牌的婴幼儿米粉进行监测检验，每份样品测定3次，回收测定2次，取平均值，部分结果见表3。

表3 15份加标硝酸盐和亚硝酸盐测定值和回收率Table 3 NO2-and NO3-value and recovery rate of 15 samples

米粉中亚硝酸盐（以NO2-计）浓度为未检出~0.4mg/kg，硝酸盐（以 NO3-计）浓度为 5.2 mg/kg~18.7 mg/kg，这50份米粉中亚硝酸盐和硝酸盐的含量均小于限量标准。亚硝酸盐回收率为89.5%~96.0%，硝酸盐回收率为89.8%~96.1%，表明本方法准确度较高，适用于婴幼儿米粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定。

3 结论

婴幼儿是国家和民族的希望，婴幼儿米粉的安全备受关注。婴幼儿米粉成分复杂，除含有蛋白质、脂肪、碳水化合物之外，还添加多种食品添加剂，如维生素、糖类、无机盐等，本方法采用离心分离样液，过柱后采用在线英兰超滤技术，解决了样品前处理液粘稠及过滤后样液不澄清等技术问题。结果表明，本方法高效、灵敏度高、检出限低、重复性好等特点，适用于大批量的婴幼儿米粉中硝酸盐和亚硝酸盐的测定，对婴幼儿米粉的质量控制和政府部门的安全监控具有重大意义。

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