miR-30c-1-3p在人结直肠癌组织中的表达及临床意义

陈澄亮 陈积贤 薛迪新 吴伟力 戴华卫 金凯 徐定银 曹高健 黄振丰 周瑞耀 吴道义 曾钰

结直肠癌的发生、发展是一个多方面、多环节综合调控的过程，与饮食、体力活动、遗传易感性等有一定的关系。结直肠黏膜细胞从正常向癌演变、从腺瘤发展为腺癌的过程中发生了一系列基因的改变，但目前关于这一系列变化的原因尚未明确。微小RNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，普遍存在于动植物和病毒中。miRNA已被发现在许多肿瘤中表达异常[1－2]。因此，本实验通过探讨 miR－30c－1－3p在人结直肠癌组织中的表达及临床意义，为结直肠癌在分子水平的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 标本来源 实验标本来自2014年6月至2015年6月在本院行手术治疗的52例结直肠癌患者，病理诊断均为腺癌，所有患者术前均未行放化疗；其中男30例，女 22 例；年龄 38～86（64.0±14.8）岁；结直肠癌的分期依据2015年美国国立综合癌症网络（NCCN）公布的结直肠癌TNM分期法。采集每例患者经手术切除的癌组织及距离癌组织＞5cm的癌旁正常黏膜组织各1份，液氮速冻后放置－80℃恒温冰箱中保存，留待提取miR－30c－1－3p。本实验经医院伦理委员会审查通过，采集标本前与所有患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 采用Trizol法，Total RNA Exteractor（生工生物工程有限公司）提取总RNA，按照说明书进行操作。提取完成的总RNA通过电泳检验，在紫外透射光下观察拍照。

1.2.2 反转录合成cDNA 利用提取的总RNA，miR－30c－1－3p加特异性引物，用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理后的水定容至 13μl，70°C 温水浴 5min，置于冰上冰浴 10s，离心，加入4.0μl反应缓冲液、2.0μl dNTP、1.0μl RNA 酶抑制剂、2.0μl逆转录酶（浓度为 10U/μl），37°C 温水浴5min，42°C 温水浴 60min，70°C 温水浴 10min；反应完成。

1.2.3 实时定量PCR 体系：SG Fast qPCR Master Mix（High Rox）（2X）（生工生物工程有限公司）10μl，正向引物、反向引物各 0.4μl，cDNA 模板 20μl，DEPC 处理后的水7.2μl；各基因的引物序列见表1。循环条件：初始维持 95℃ 3min；熔解 95℃ 7s，退火 57℃ 10s，延伸 72℃15s，共循环 40 次。miR－30c－1－3p 使用 U6 作为内参，计算机分析Ct值，采用2－ΔΔCt法计算相对表达量，即miR－30c－1－3p 表达水平。

表1 实时定量PCR反应引物序列

1.3 统计学处理 应用SPSS 20.0统计软件。计量资料不符合正态分布，故用 M（P25，P75）表示，组间比较采用Wilcoxon符号秩检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁正常黏膜组织中miR－30c－1－3p表达水平的比较 结直肠癌组织中miR－30c－1－3p表达水平为0.627（0.442，0.935），明显低于癌旁正常黏膜组织的 0.986（0.694，1.328），差异有统计学意义（P＜0.05）。根据扩增曲线（图 1），估计 miR－30c－1－3p扩增效率基本一致。根据熔解曲线（图2），基本判断miR－30c－1－3p产物单一，不含引物二聚体等其他非目的性产物，熔解温度为82.08℃。

图1 miR-30c-1-3p扩增曲线

图2 miR-30c-1-3p熔解曲线

2.2 结直肠癌组织中miR－30c－1－3p表达水平与患者临床特征的关系 结直肠癌组织中miR－30c－1－3p表达水平与患者有无淋巴结转移、临床分期有关（均P＜0.05），有淋巴结转移、临床分期Ⅲ～Ⅳ期的患者结直肠癌组织中miR－30c－1－3p表达水平均较低；与患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置、分化程度、浸润深度等均无关（均 P＞0.05），见表2。

3 讨论

在结直肠肿瘤中，有些基因被认为是导致肿瘤进展的癌基因如K－ras基因，有些被认为是抑癌基因如APC基因；此外，错配修复基因的突变、基因过度表达等在肿瘤进展中也起到重要作用。miRNA是近年来作为抑癌基因或原癌基因被报道较多的小分子基因，已发现其在许多肿瘤组织中表达异常，且参与肿瘤的生长[3]、增殖[4]、侵袭[5]、转移[6]、凋亡等，被认为是治疗肿瘤的新靶点[7-8]。

miR-30c是miRNA家族的成员之一。近年来研究表明miR-30c-1-3p通过3′非编码区改变靶基因细胞色素p450 3A4，从而使受体不表达[9]。相关研究报道miR-30c在乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤组织中表达升高[10-11]，Huang等[12]研究发现miR-30c通过靶基因ASF/SF2肿瘤蛋白剪接因子来抑制前列腺癌细胞的存活。Agostini等[13]研究认为miR-30c在卵巢肿瘤组织中表达下调。Cao等[14]研究发现miR-30c-5p通过靶点MTA1来抑制胃癌的迁移以及上皮细胞到间叶细胞的转变。Wang等[15]研究发现miR-30a-5p通过调节GRP78表达，从而抑制肾细胞癌的生长。Kawaguchi等[16]认为乳腺癌患者生存率的提高与miR-30a的高表达有关。除了肿瘤学领域，miR-30c还被发现能减少高血脂和2型糖尿病小鼠的血浆TC水平[17]。Singh等[18]研究表明恢复miR-30a的表达，能抑制神经母细胞瘤的致瘤性，且有自噬抑制作用。本研究结果发现miR-30c-1-3p在结直肠癌组织中的表达明显下调，与患者有无淋巴结转移、临床分期等有关，与患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置、分化程度、浸润深度等无关；这提示miR-30c-1-3p可能与结直肠癌的转移侵袭相关。因此，笔者提出大胆假设：在结直肠癌的发生过程中，miR-30c-1-3p表达水平会降低；若能通过方法将miR-30c-1-3p的表达上调，有望抑制结直肠癌的进展。

综上所述，miR-30c-1-3p在人结直肠癌组织中表达下调，与有无淋巴结转移、临床分期有关；提示miR-30c-1-3p可能与结直肠癌的转移侵袭相关。

表2 结直肠癌组织中miR-30c-1-3p表达水平与患者临床特征的关系

[1]Chruscik A,Lam AK.Clinicalpathologicalimpacts of micrornas in papillary thyroid carcinoma:A crucial review[J].Experimental and molecular pathology,2015,99(3):393-398.

[2]Hollis M,Nair K,Vyas A,et al.Micrornas potential utility in colon cancer:Early detection,prognosis,and chemosensitivity[J].World journalof gastroenterology,2015,21(27):8284-8292.

[3]Xu Y,Chen J,Gao C,et al.Microrna-497 inhibits tumor growth through targeting insulin receptor substrate 1 in colorectal cancer[J].Oncology letters,2017,14(6):6379-6386.

[4]Li D,Wang H,Song H,et al.The micrornas mir-200b-3p and mir-429-5p target the limk1/cfl1 pathway to inhibit growth and motility of breast cancer cells[J].Oncotarget,2017,8(49):85276-85289.

[5]Boguslawska J,Rodzik K,Poplawski P,et al.Tgf-beta1 targets a microrna network that regulates cellular adhesion and migration in renalcancer[J].Cancer letters,2018,412:155-169.

[6]Mjelle R,Sellaeg K,Saetrom P,et al.Identification of metastasis-associated micrornas in serum from rectal cancer patients[J].Oncotarget,2017,8(52):90077-90089.

[7]Bahrami A,Aledavood A,Anvari K,et al.The prognostic and therapeutic application of micrornas in breast cancer:Tissue and circulating micrornas[J].Journal of cellular physiology,2018,233(2):774-786.

[8]Moridikia A,Mirzaei H,Sahebkar A,et al.Micrornas:Potential candidates for diagnosis and treatment of colorectal cancer[J].Journalof cellular physiology,2018,233(2):901-913.

[9]Vachirayonstien T,Yan B.Microrna-30c-1-3p is a silencer of the pregnane x receptor by targeting the 3'-untranslated region and alters the expression of its target gene cytochrome p450 3a4[J].Biochimica et biophysica acta,2016,1859(9):1238-1244.

[10]Yen MC,Shih YC,Hsu YL,et al.Isolinderalactone enhances the inhibition of socs3 on stat3 activity by decreasing mir-30c in breast cancer[J].Oncology reports,2016,35(3):1356-1364.

[11]Ling XH,Chen ZY,Luo HW,et al.Bcl9,a coactivator for wnt/beta-catenin transcription,is targeted by mir-30c and is associ-ated with prostate cancer progression[J].Oncology letters,2016,11(3):2001-2008.

[12]Huang YQ,Ling XH,Yuan RQ,et al.Mir30c suppresses prostate cancer survivalby targeting the asf/sf2 splicing factor oncoprotein[J].Molecular medicine reports,2017,16(3):2431-2438.

[13]Agostini A,Brunetti M,Davidson B,et al.Genomic imbalances are involved in mir-30c and let-7a deregulation in ovarian tumors:Implications for hmga2 expression[J].Oncotarget,2017,8(13):21554-21560.

[14]Cao JM,LiGZ,Han M,et al.Mir-30c-5p suppresses migration,invasion and epithelial to mesenchymal transition of gastric cancer via targeting mtal[J].Biomedicine&pharmacotherapy,2017,93:554-560.

[15]Wang C,Cai L,Liu J,et al.Microrna-30a-5p inhibits the growth of renal cell carcinoma by modulating grp78 expression[J].Cellular Physiology&Biochemistry International Journal of Experimental Cellular Physiology Biochemistry&Pharmacology,2017,43(6):2405.

[16]Kawaguchi T,Yan L,Qi Q,et al.Overexpression of suppressive micrornas,mir-30a and mir-200c are associated with improved survival of breast cancer patients[J].Scientific reports,2017,7(1):15945.

[17]Irani S,Iqbal J,Antoni WJ,et al.Microrna-30c reduces plasma cholesterol in homozygous familial hypercholesterolemic and type 2 diabetic mouse models[J].Journaloflipid research,2017.pii:jlr.M081299.doi:10.1194/jlr.M081299.[Epub ahead of print]

[18]Singh SV,Dakhole AN,Deogharkar A,et al.Restoration of mir-30a expression inhibits growth,tumorigenicity of medulloblastoma cells accompanied by autophagy inhibition[J].Biochemical and biophysical research communications,2017,491(4):946-952.