结肠镜活检组织检测MGMT和galectin—3的表达在结肠腺癌中的临床意义

苏赓 梁科庆 罗显克 温伟

[摘要] 目的 检测结肠腺癌活检组织中DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）和半乳糖凝集素-3（galectin-3）的表达在结肠腺癌中的临床意义。 方法 选取2010年1月～2015年1月广西壮族自治区民族医院结肠镜活检的120例患者标本组织（包括60例结肠腺癌、30例炎性结肠黏膜病变和30例不典型增生结肠黏膜病变），通过免疫组化SP方法检测MGMT蛋白、galectin-3蛋白的表达情况，并通过随访了解预后情况。 结果 与炎性肠黏膜病变组比较，结肠腺癌组MGMT阳性表达降低，galectin-3阳性表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与中-高分化结肠腺癌组比较，低分化结肠腺癌组中MGMT阳性表达降低，galectin-3阳性表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;与有淋巴结转移的结肠腺癌组比较，无淋巴结转移的结肠腺癌组MGMT阳性表达升高，galectin-3阳性表达降低，差异有统计学意义（P < 0.05）;MGMT在结肠腺癌组织中的表达随着TNM分期增高而降低，galectin-3的表达随着TNM分期增高而增高，差异有统计学意义（P < 0.05）;MGMT和galectin-3的表达与结肠腺癌患者的年龄、性别无关（P > 0.05）。MGMT和galectin-3在结肠腺癌中的表达呈负相关（r = -0.399，P = 0.002）;MGMT和galectin-3在结肠腺癌中的阳性表达率与患者的3年生存率明显相关（P < 0.05）。 结论 MGMT和galectin-3在结肠腺癌的发生、发展过程中起重要作用，檢测结肠腺癌组织中MGMT和galectin-3的表达有助于判断肿瘤的恶性程度、病情进展及预后。

[关键词] 炎性肠黏膜病变;结肠黏膜不典型增生;结肠腺癌;O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶;半乳糖凝集素-3

[中图分类号] R574.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（b）-0094-05

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significances of DNA repair enzyme O6-methylguanine DNA methyltransferase （MGMT） and galectin-3 in colon adenocarcinoma tissues collected with fibro colonoscopy. Methods From January 2010 to January 2015， the tissues with fibro colonoscopy from 120 patients treated in Minzu Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region were collected， including 60 colon adenocarcinomas， 30 inflammatory bowel diseases， and 30 colonic mucosal atypical hyperplasias. The expression of MGMT and galectin-3 were measured by immunohistochemical SP method and the prognosis was evaluated by follow-up visit. Results Compared with the inflammatory bowel disease group， the positive expression of MGMT significantly decreased and the positive expression of galectin-3 significantly increased in the colon adenocarcinomas group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with medium-high differentiation colon adenocarcinoma group， the positive expression of MGMT significantly decreased and the positive expression of galectin-3 significantly increased in poor differentiation colon adenocarcinoma group， the differences were statistically significant （P < 0.05）; the expression of MGMT in colon adenocarcinoma decreased with the increase of TNM stage， and the expression of galectin-3 increased with the increase of TNM stage， the differences were statistically significant （P < 0.05）; the expression of MGMT and galectin-3 were not related to age and gender （P > 0.05）. There was a negative association between the expression level of MGMT and galectin-3 in colon adenocarcinoma （r = -0.399，P = 0.002）; the positive expression rate of MGMT and galectin-3 in colon adenocarcinoma were significantly correlated with the 3-year survival rate of patients （P < 0.05）. Conclusion MGMT and galectin-3 might play important roles in tumorigenesis and development of colon adenocarcinoma， they are promising biomarkers for colon adenocarcinoma staging， metastasis and prognosis .

[Key words] Inflammatory bowel disease; Colonic mucosal atypical hyperplasia; Colon adenocarcinoma; MGMT; Galectin-3

结肠癌是最常见的胃肠癌类型之一，目前仍然是全球癌症相关死亡的主要原因[1]。结肠腺癌是最常见的结肠癌类型，占新诊断结肠癌病例的98%[2]。结肠镜活检是预防及早期发现结肠癌的重要手段，手术治疗联合其他治疗方案（放射治疗、射頻消融、化疗）是标准的治疗策略。尽管在诊断和治疗方面取得了一定的进展，但由于肿瘤转移引起的相关并发症，患者的预后仍然很差。研究表明很多恶性肿瘤的发生、发展及预后与DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）和半乳糖凝集素-3（galectin-3）表达异常有关[3]。本研究通过免疫组化SP法对结肠镜活检组织中的60例结肠腺癌、同期30例炎性结肠黏膜病变和30例不典型增生结肠黏膜病变标本中MGMT和galectin-3的表达进行研究，为临床筛选高危人群、判断结肠腺癌恶性程度、选择治疗方案及评价预后提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年1月～2015年1月广西壮族自治区民族医院（以下简称“我院”）经结肠镜活检并病理证实的60例结肠腺癌患者和同期30例炎性结肠黏膜病变、30例不典型增生结肠黏膜病变患者的资料。60例结肠腺癌患者中，女25例，男35例;年龄30～82岁，平均年龄（60±12.7）岁，其中年龄≥60岁的37例，年龄<60岁的23例;镜下病理分级中-高分化腺癌36例，低分化腺癌24例;术后及影像学检查发现，结肠腺癌淋巴结转移35例，无淋巴结转移25例，肿瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期的患者32例，Ⅲ+Ⅳ期患者28例;所有病例术前均未经放、化疗，全部病例跟踪随访，并以3年生存率作为反映预后的指标。结肠腺癌标本的入选依据中国结直肠癌诊疗规范（2017版）分类标准，由两位病理医师经双盲法重新复诊切片。参与本研究的所有患者均对本研究知情并签署知情同意书。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 免疫组化

MGMT和galectin-3单克隆即用型抗体均购自福州迈新生物技术公司，标本按常规SP法染色。设立对照：以已知MGMT和galectin-3阳性组织切片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

在光学显微镜下结合HE片观察免疫组化片染色结果，结果判定采用双盲法，随机选择10个高倍视野，每个视野计算100个肿瘤细胞，按照阳性细胞所占比例计分，无阳性细胞计0分，<11%计1分，11%～ <51%计2分，≥51%计3分。染色强度计分：无棕黄色计0分，微弱棕黄色计1分，中等强度棕黄色计2分，褐色或棕褐色计3分。两者评分相乘<2分为阴性表达，≥2分为阳性表达。MGMT染色定位于细胞核和/或细胞质，galectin-3染色定位于细胞质。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对所得数据进行统计分析，计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验，相关分析采用Spearman等级相关。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MGMT和galectin-3在炎性结肠黏膜病变、不典型增生结肠黏膜病变和结肠腺癌中的表达

从炎性病变到不典型增生到恶性病变，MGMT表达逐渐降低，galectin-3表达逐渐升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;结肠腺癌MGMT阳性表达率低于炎性结肠黏膜病变，galectin-3阳性表达率高于炎性结肠黏膜病变，差异有统计学意义（P < 0.05）;结肠腺癌与不典型增生结肠黏膜病变组间、炎性结肠黏膜病变与不典型增生结肠黏膜病变组间MGMT和galectin-3表达比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。MGMT和galectin-3在炎性结肠黏膜病变、不典型结肠黏膜病变和结肠腺癌中免疫组织化学染色情况见图1～2（封四）。

2.2 MGMT和galectin-3在结肠腺癌中的表达与临床生物学特性关系

低分化结肠腺癌组中MGMT阳性表达低于中-高分化结肠腺癌组，galectin-3阳性表达高于中-高分化结肠腺癌组，差异有统计学意义（P < 0.05）;无淋巴结转移的结肠腺癌组MGMT阳性表达高于有淋巴结转移的结肠腺癌组，galectin-3阳性表达低于有淋巴结转移的结肠腺癌组，差异有统计学意义（P < 0.05）;MGMT在结肠腺癌组织中的表达随着TNM分期增高而降低，galectin-3在结肠腺癌组织中的表达随着TNM分期增高而增高，差异有统计学意义（P < 0.05）;结肠腺癌患者年龄及性别与MGMT及galectin-3的表达无关（P > 0.05）。见表2。

2.3 MGMT和galectin-3在结肠腺癌中表达的相关性

应用Spearman等级相关分析MGMT和galectin-3表达的相关性，相关系数r = -0.399，P = 0.002，提示MGMT和galectin-3表达呈负相关。

2.4 MGMT和galectin-3的表达与结肠腺癌患者生存时间的关系

随访调查60例结肠腺癌患者发现，3年内死亡16例，存活44例，3年生存率为73.33%。死亡患者中MGMT阳性表达率明显低于存活患者（P < 0.05），galectin-3阳性表达率明显高于存活患者（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

DNA修复酶MGMT稳定地存在于人体各种组织内，分子结构上的启动子富含GC碱基，顺式作用元件（GRE）包含2个糖皮质激素反应元件、核转录因子激活蛋白-1（AP-1）元件、CpG岛中的6个Spl位点[4]，其通过去除烷基加合物来抵消烷化剂的致染色体畸变作用，从而防止交联形成并由此引起对烷基化药物的抗性，位于MGMT启动子区域中的CpG岛的甲基化主要负责几种肿瘤类型中相关基因的失活[5-6]。研究结果表明，MGMT的表达水平在肝细胞性肝癌、胃癌、乳腺癌的总体生存率中是一个重要的预警指标[7-9]。然而，MGMT表达与结肠腺癌的临床病理特征之间的关系仍不清楚。目前大部分研究都集中于结肠腺癌的MGMT启动子的甲基化状态的激活因素。有研究报道结直肠癌中MGMT启动子区CpG岛存在过度甲基化，导致MGMT表达的缺失不能修复基因损伤，因此引起肿瘤的发生，这是目前为止最广为接受的结肠腺癌发生机制之一[10]。本研究发现，MGMT在炎性结肠黏膜病变-不典型增生结肠黏膜病变-结肠腺癌这一病变过程中，阳性率逐级下降，有淋巴结转移组MGMT表达低于无淋巴结转移的结肠腺癌组，病理分级低分化组MGMT表达明显高于高分化组，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期明显高于Ⅰ～Ⅱ期，差异均有统计学意义。可能机制是结肠腺癌中MGMT启动子区CpG岛存在过度甲基化，导致MGMT表达的缺失不能修复基因损伤，因此引起恶性肿瘤的发生[11]，并且在相应的随访病例中，MGMT低表达者预后较差，监测MGMT的表达有助于判断其预后。

galectin-3是凝集素家族的成员，galectin-3蛋白在细胞核中产生，主要定位于细胞表面和细胞外基质中，通过与相应配体的相互作用发挥多种功能[12-14]。galectin-3通过与细胞黏附相关分子结合并抑制细胞-细胞和细胞-基质相互作用来调节转移，从而增加癌细胞脱离和迁移率。临床研究表明，galectin-3在包括食管癌和肺癌在内的多种实体瘤组织中高度表达[15-16]。Korkmaz等[17]報道，结肠直肠腺癌组织中galectin-3的表达显著高于正常肠组织。这些报道提示，galectin-3在结肠腺癌的发生和发展中起重要作用。在本研究中，我们发现galectin-3在炎性结肠黏膜病变-不典型结肠黏膜病变-结肠腺癌这一病变过程中，阳性率逐级上升，癌组织阳性率明显高于非癌组织。这一发现与Mazurek等[18]的报道一致，提示galectin-3可能参与结肠癌的发生和发展。本研究还发现肿瘤淋巴结转移者、分化程度低、TNM分期晚的患者galectin-3阳性表达率较高，这些参数是预后相对较差的指标。分析galectin-3表达水平与生存率之间的关系，结果显示3年内死亡患者的galectin-3阳性表达率明显高于存活患者。这一结果提示，galectin-3的阳性表达与恶性结肠腺癌的生物学行为有关，可作为患者预后不良的预测指标。

本研究发现MGMT和galectin-3在结肠腺癌中的表达呈负相关，也就是说结肠腺癌发生、发展过程中如果失去MGMT的正常表达，可能意味着galectin-3过度表达，反之亦然。导致这种结果的原因可能是两者形成特殊的复合体在结肠腺癌的发生、发展及转移中发挥拮抗作用，同时MGMT与galectin-3有共同的基因定位，推测两种蛋白可能有直接或间接的关联，因此MGMT及galectin-3在结肠腺癌中的表达具有显著相关性，在其发生、发展及转移中可能发挥着拮抗作用。当然，这需要更大量数据及更深层次的实验来证实。

总之，MGMT、galectin-3与结肠腺癌的发生及进展相关，MGMT的低表达和galectin-3的高表达促进了结肠腺癌发生、发展，是瘤细胞进一步转化和恶变的分子异常事件，可作为早期诊断结肠癌癌前病变和结肠癌的筛查指标之一。结肠镜活检组织中联合检测MGMT和galectin-3的表达在结肠腺癌的防治中可能有良好的应用前景。

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（收稿日期：2018-06-29 本文編辑：罗乔荔）