柑橘素预处理对大鼠缺血/再灌注心脏损伤后能量代谢的影响

[摘要] 目的 探讨柑橘素预处理对大鼠缺血/再灌注心脏损伤后能量代谢的影响。 方法 将50只雄性成年Sprague-Dawlay大鼠按照随机数字表法分为五组（n = 10）：空白对照组、模型组和柑橘素低、中、高剂量组（5、10、20 μmol/L）。各组大鼠心脏分别给予30 min全心缺血，然后给予120 min再灌注;柑橘素低、中、高剂量组大鼠分别在缺血前给予5、10、20 μmol/L柑橘素预处理;灌注结束后测定各组大鼠心肌乳酸脱氢酶含量、心肌梗死面积，测定心肌组织Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力。 结果 缺血再灌注损伤后，与模型组比较，柑橘素低、中、高剂量组乳酸脱氢酶含量下降（P < 0.05或P < 0.01），心肌梗死面积减小（P < 0.05或P < 0.01），心肌组织Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力升高（P < 0.05）。 结论 柑橘素可能通过增强缺血/再灌注大鼠心肌的能量代谢，发挥心脏保护作用。

[关键词] 柑橘素;缺血/再灌注;能量代谢;大鼠

[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（b）-0022-04

ischemia/reperfusion in rats. Methods According to random number table method， 50 adult male Sprague-Dawley （SD） rats were divided into five groups （n = 10）： blank control group， modle group， and low， medium， high dose of naringenin group （5， 10， 20 μmol/L）. The heart of rat in each group was treated with 30 min global ischemia followed by 120 min reperfusion; the rats of low， medium， high dose of naringenin group were treated with 5， 10， 20 μmol/L of naringenin perfusion before ischemia; after reperfusion， the myocardial content of lactate dehydrogenates and myocardial infarct size in each group were examined， the activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in myocardial tissue were detected. Results After ischemia/reperfusion injury， compared with modle group， the contents of lactate dehydrogenates in low， medium， high dose of naringenin group were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， the myocardial infarct size was significantly reduced （P < 0.05 or P < 0.01）， the activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in myocardial tissue were significantly improved （P < 0.05）. Conclusion Narigenin palys a cardioprotective role may be through enhancing the myocardial energy metabolism of rats with ischemia/reperfusion.

[Key words] Naringenin; Ischemia/reperfusion; Energy metabolism; Rats

柑橘素，屬二氢黄酮类，存在于葡萄柚、柠檬、番茄等蔷薇科、芸香科植物的果实或者果皮中[1]。柑橘素具有多种生物学活性，目前报道的有抑制肿瘤细胞增殖[2]、抑制炎症水平[3]、抗氧化[4]、降糖[5]、改善动脉粥样硬化[6]等。近年来研究发现，柑橘素对大鼠的心肌损伤有保护作用[7]。本研究通过应用大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的模型，探讨柑橘素保护大鼠心脏缺血/再灌注损伤的作用机制是否与能量代谢有关。

1 材料与方法

1.1 试剂

采用美国Sigma公司生产的柑橘素（生产批号：201 30503）。以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂，溶解柑橘素，配成柑橘素母液，所需柑橘素浓度由灌流液（即K-H液：NaCl 118.3 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 25 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，pH为7.35～7.4）稀释所成。乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（生产批号：20130103）、ATP酶试剂盒（生产批号：20140410）、考马斯亮蓝试剂盒（生产批号：20110210）均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 实验动物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠50只，体重280～300 g，1月龄，正常大鼠生长环境喂养。河北医科大学动物中心提供，合格证号：SCXK（冀）2014-1-003。所有动物实验遵照《实验动物关怀与使用指南（Publication revised 1996;National Institutes of Health，Bethesda，MD）》进行，所有实验程序均由河北医科大学动物使用委员会批准。将实验动物按随机数字表法分为五组：空白对照组、模型组和柑橘素低、中、高剂量组（5、10、20 μmol/L）。

1.3 缺血再灌注损伤模型制备

大鼠以戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，仰卧位固定，迅速开胸后取出心脏。将心脏置于氧饱和的4℃ K-H液中，剪开心包，将主动脉接于Langendorff灌流装置，以37℃氧饱和的K-H液进行恒压恒温逆向灌流（灌流压力为80 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa）。大鼠心脏经K-H液灌流稳定30 min后，给予30 min全心缺血，然后给予120 min再灌注处理;造模成功标准为缺血再灌注后，心肌舒缩功能出现障碍，形态上出现心肌梗死。

1.4 动物分组与给药

空白对照组大鼠只给予K-H液平衡灌流180 min;模型组大鼠给予K-H液平衡灌流30 min，缺血30 min，复灌120 min;柑橘素低、中、高剂量组大鼠心脏在缺血前分别给予5、10、20 μmol/L浓度的柑橘素液灌流10 min，再予缺血30 min，复灌120 min。

1.5 心脏流出液LDH含量测定

各组大鼠分别在复灌后60 min采集心脏冠脉流出液，应用比色法，利用分光光度计，按照LDH试剂盒说明书操作。

1.6 ATP酶活力测定

灌流结束后，取部分心肌组织，生理盐水洗净血迹，制成匀浆，离心，取上清。采用定磷法，应用分光光度计测定OD值，计算Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶含量，操作严格按照试剂盒说明书操作步骤进行。

1.7 心肌梗死面積（MIS）测定

灌流结束后，取下心脏，将心室切成均匀的5片。将其置于37℃的10% TTC溶液中避光孵育15 min，甲醛固定2 h。以数码相机采集图像，运用ImageProPlus 7.0软件图像分析系统进行分析。梗死区域呈苍白色，MIS为梗死区占心室总面积的百分比。

1.8 统计学方法

应用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 柑橘素对冠脉流出液LDH的影响

缺血/再灌注60 min时，空白对照组冠脉流出液中的LDH明显低于模型组（P < 0.01），柑橘素低、中、高剂量组冠脉流出液中LDH含量均显著低于模型组（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

2.2 柑橘素预处理对MIS的影响

缺血再灌注120 min后，柑橘素低、中、高剂量组MIS均明显低于模型组（P < 0.05或P < 0.01），且柑橘素中、高剂量组MIS明显低于柑橘素低剂量组（P < 0.05）。空白对照组未出现心肌梗死，不纳入统计范围。见表1。

2.3 柑橘素预处理对ATP酶活力的影响

缺血/再灌注后，模型组大鼠心肌组织Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力均较空白对照组显著降低（P < 0.01）;柑橘素预处理可不同程度地影响ATP酶活力，与模型组比较，柑橘素低、中、高剂量组可升高Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

Jennings等[8]发现犬的心脏严重缺血后恢复再灌注会加重心肌坏死的程度。这种心肌细胞因缺血而发生可逆性的损伤，恢复血供后会使损伤加重，引起细胞死亡或进一步的功能障碍，称之为缺血/再灌注损伤[9]。再灌注损伤后可引起心律失常[10]、心肌结构改变[11]、心肌坏死，以及血流动力学改变[12]。而MIS直接影响心功能的恢复及预后[13]。药物预处理在心肌缺血前发挥作用，可以起到对抗心肌缺血/再灌注损伤的作用[14]。Subburaman等[15]研究发现，化疗所致的心肌损伤大鼠模型中，柑橘素对心脏起保护作用。另有国外研究表明，在心肾综合征大鼠模型中，柑橘素可以改善心室重构和心功能，抑制氧化应激[16]。本研究发现，柑橘素预处理可以缩小大鼠缺血/再灌注损伤后的MIS，提示柑橘素预处理对心肌缺血/再灌注损伤有保护作用，可以改善心室功能。

缺血/再灌注损伤后，心肌细胞膜通透性增强，大量细胞内酶包括LDH、肌酸激酶（CK）、谷草转氨酶（AST）弥散至细胞外，这些酶的增高代表心肌损伤的加重[17]。本研究通过测定缺血/再灌注后大鼠心肌组织中LDH活性，来检测心肌细胞的损伤程度，结果显示，柑橘素组冠脉流出液中的LDH含量较模型组降低。提示柑橘素可以稳定心肌细胞膜，保护受损伤的心肌。

缺血/再灌注损伤过程中，可发生氧自由基损伤、钙离子超载、能量代谢障碍、炎症介质释放等[18]。研究认为，心肌缺血/再灌注损伤的起始环节是能量代谢障碍[19-21]。心肌组织中Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶存在于细胞膜上，是维持心肌细胞兴奋传导、稳定细胞内环境的物质基础[22]。当心肌缺血发生时，能量代谢发生障碍，细胞内ATP减少，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性下降，从而导致细胞内Na+、Ca2+积聚，K+、Mg2+流失[23]，造成细胞内高钙、低钾血症。细胞内钙超载会加重线粒体损伤，破坏细胞膜结构，最终引起心肌细胞的能量缺乏，造成迟发性细胞死亡等[24-25]。本研究结果显示，与空白对照组比较，模型组Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活性显著下降。而柑橘素低、中、高剂量组可以明显提高心肌组织中的Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活性，并且具有剂量依赖性。提示柑橘素预处理可以通过调节大鼠心脏缺血/再灌注损伤后的离子失衡，维持细胞内环境稳态，促进能量代谢的恢复。

综上所述，柑橘素对大鼠心脏缺血/再灌注损伤具有保护作用，其作用可能与减少MIS、提高ATP酶活性、改善能量代谢有关，具体机制有待进一步研究。

[参考文献]

[1] Tsai SJ，Huang CS，Mong MC，et al. Anti-inflammatory and antifibrotic effects of naringenin in diabetic mice [J]. J Agric Food Chem，2012，60（1）：514-521.

[2] Lou C，Zhang F，Yang M，et al. Naringenin decreases invasiveness and metastasis by inhibiting TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition in pancreatic cancer cells [J]. PLoS One，2013，7（12）：e50956.

[3] Karuppagounder V，Arumugam S，Thandavarayan RA，et al. Naringenin ameliorates daunorubicin induced nephrotoxicity by mitigating AT1R ERK1/2-NFκB p65 mediated inflammation [J]. Int Immunopharmacol，2015，28（1）：154-159.

[4] Rahigude，A，Bhutada，P，Kaulaskar，S，et al. Participation of antioxidant and cholinergic system in protective effect of naringenin against type-2 diabetes-induced memory dysfunction in rats [J]. Neuroscience，2012，9（26）：62-72.

[5] Tsai SJ，Huang CS，Mong MC，et al. Anti-inflammatory and antifibrotic effects of naringenin in diabetic mice [J]. Agric Food Chem，2012，60（1）：514-521.

[6] Yoshida H，Watanabe W，Oomagari H，et al. Citrus flavonoid naringenin inhibits TLR2 expression in adipocytes [J]. Nutr Biochem，2013，24（7）：1276-1284.

[7] Ramprasath T，Senthamizharasi M，Vasudevan V，et al. Naringenin confers protection against oxidative stress through Upregulation of Nrf2 target genes in cardiomyoblastcells [J]. J Physiol Biochem，2014，70（2）：407-415.

[8] Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al. Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog [J]. Arch Pathol，1960，70：68-78.

[9] 孟利敏，吳绍华，席树强，等.柑橘素预处理对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国医药导报，2017， 14（18）：20-24.

[10] Ghiasl R，Mohammad M，Majidina M，et al. The effects of mebudipine on myocardial arrhythmia induced by ischemia-reperfusion injury in isolated rat heart [J]. Cell Mol Biol（Noisyle-grand），2016，62（13）：15-20.

[11] Meng G，Wang J，Xiao Y，et al. GYY4137 protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by attenuating oxidative stress and apoptosis in rats [J]. J Biomed Res，2015，29（3）：203-213.

[12] 刘丹，金良友，冯晓灵，等.柚皮苷对心肌缺血- 再灌注损伤大鼠血流动力学的影响[J].重庆医学，2018，47（6）：733-739.

[13] 胡珍，陈景瑞，魏静，等.冠状动脉结扎制备大鼠心肌梗死模型及评价实验研究[J].天津中医药，2016，33（2）：90.

[14] 国科，刘达兴，容松.心肌缺血再灌注损伤的发生机制及其防治策略[J].中国医药导报，2016，13（29）：37-40.

[15] Subburaman S，Ganesan K，Ramachandran M. Protective role of naringenin against doxorubicin-induced cardiotoxicity in a rat model：histopathology and mRNA expression profile studies [J]. J Environ Pathol Toxicol Oncol，2014， 33（4）：363-376.

[16] Liu Y，An BS，Gao A. Protective effects of naringenin in cardiorenal syndrome [J]. J Surg Res，2016，203（2）：416-423.

[17] Gürsul C，Ekinci Akdemir FN，Akkoyun T，et al. Protectice effect of Naringin on experimental hindlimb ischemia/reperfusion injury in rats [J]. J Enzyme Inhib Med Chem，2016，31（sup1）：56-61.

[18] Ibanez B，Fuster V，Jimenez-Borreguero J，et al. Lethal myocardial reperfusion injury：a necessary evil [J]. Int J Cardiol，2011，151（1）：3-11.

[19] 谭玉婷，鲁卫星，赵俊男，等.龙牙楤木总皂苷对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞线粒体细胞色素C和膜电位的影响及其作用机制[J].西部中医药，2016，29（12）：9-12.

[20] 佟彤，刘红旭，尚菊菊，等.参元丹对缺血再灌注心肌细胞内质网应激相关因子GRP78、CHOP表达的影响[J].世界中医药，2016，11（3）：407-409.

[21] Qin H，Walcott GP，Killingsworth CR，et al. Impact of myocardial ischemia and reperfusion on ventricular defibrillation patterns，energy requirements，and detection of recovery [J]. Circulation，2002，105（（21）：2537-2542.

[22] Wang HY，O'Doherty GA. Modulators of Na/K-ATPase：a patent review [J]. Expert Opin Ther Pat，2012，22（6）：587-605.

[23] Gadeberg HC，Bryant SM，James AF，et al. Altered Na/Ca exchange distribution in ventricular myocytes from failing hearts [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2016，310（2）：H262-H268.

[24] 姚期，余資江，孙宝飞，等.松树皮提取物对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[J].中国实验动物学报，2017，25（6）：632-636.

[25] 程永生，陈宇，李冬.钙超载及其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用机制研究现状[J].中国医学创新，2013，10（3）：150-151.

（收稿日期：2018-08-29 本文编辑：张瑜杰）