携带人VEGF165、Ang1基因的AAV—2促血管新生研究

蔡冠军 谭最 章长杰

【摘要】 目的：通过观测携带人血管内皮生长因子-165（vascular endothelial growth factor，VEGF165）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang1）基因的重组腺相关病毒-2（adeno-associated virus，AAV-2）对兔肌组织的生物学效应，探讨其促进血管再生的能力。方法：选取雄性新西兰大白兔32只，随机分为四组，每组各8只。用携带人VEGF165基因的病毒载体AAV-2-hVEGF165、携带人Ang1基因的病毒载体AAV-2-hAng1、携带-半乳糖苷酶（-gal）基因的rAAV-2-LacZ同时携带人Ang1/VEGF165基因的病毒载体AAV-2-hAng1/VEGF165直接注射新西兰雄性大白兔肌组织中，4周后利用肉眼观察和免疫组织化学染色法检测它们的血管再生效应。结果：注射AAV-2-hAng1/VEGF165的肌组织内再生的血管丰富密集且管径粗大，明显优于AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1、AAV-2-LacZ的血管再生效應。结论：同时携带人Ang1、VEGF16两种基因的AAV-2在肌组织中发挥最强的血管再生效应，单独携带人Ang1、VEGF16两种基因的AAV-2在肌组织也具有促进血管再生效应。AAV-2-hAng1/VEGF165不但可促进缺血肢体的血管生成、动脉生成、血流量的恢复，并且可降低血管的通透性，其疗效优于

AAV-2-hVEGF165、AAV-2- hAng1、AAV-2-LacZ的单独应用。

【关键词】 血管生成素1； 血管内皮生长因子； 腺相关病毒； 血管新生

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.28.004

随着社会人口老龄化的发展，缺血性血管疾病日益增多，已经成为威胁人类的主要疾病之一，其治疗最终要靠血管的再生。VEGF165是一种强烈的有丝分裂素，也是一种分泌性分子，以可溶性调节物的形式调节内皮细胞的生长和血管形成，引起血管内皮细胞增殖，促进新生血管生成[1-5]。Ang1是新近发现的与血管生长密切相关的生物因子[6]，对血管内皮细胞有特异性作用，可诱导血管芽生，对内皮细胞有很重要的化学趋化反应及血管网状形成作用[7]，通过多种途径来维持血管的稳定性和完整性，是特异的血管生成正调节因子。本研究将同时携带人VEGF165、Ang1基因的重组腺相关病毒直接注射到新西兰雄性大白兔下肢肌组织中，对比单独应用，探讨其是否可提高促血管再生能力。

1 材料与方法

1.1 材料 质粒phVEGF165、质粒phAng1、质粒phAV、质粒ph-LacZ、（有前期构建）AAV-Helper-Free System、感受态细胞Top10F、HEK293细胞株、高纯度质粒小提中量试剂盒、磷酸钙法细胞转染试剂盒、平滑肌肌动蛋白（-SMA）一抗（DAKO）。

1.2 方法

1.2.1 rAAV载体的制备 pAAV-Ang1，pAAV-Helper，pAAV-RC，各2 g用磷酸钙沉淀法共转染HEK293细胞后继续培养24 h，用氯仿处理-PEG/NaCL沉淀-氯仿抽提法，此即得到初步浓缩纯化病毒AAV-2-hAng1[8]。同此方法制备AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1/VEGF165、AAV-2-LacZ。

1.2.2 AAV-2病毒的高浓缩纯化 将制备的病毒AAV-2-hAng1、AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1/VEGF165、AAV-2-LacZ用centriplus YM-100的超滤管进行浓缩纯化。

1.2.3 实验分组 选取月龄为5～7个月，雄性新西兰大白兔32只，体重2.0～2.5 kg，将它们分成四组，分组如下：（1）携带人VEGF165基因的病毒载体处理组（AAV-2-hVEGF165组）；（2）携带人Ang1基因的病毒载体处理组（AAV-2-hAng1组）；（3）携带-半乳糖苷酶（-gal）基因的处理组（rAAV-2-LacZ组）；（4）携带人Ang1/VEGF165基因的病毒载体处理组（AAV-2-hAng1/VEGF165），每组8只。对AAV-2-hAng1组，在每只实验动物右上肢注射AAV-2-hAng1，2 mL。对AAV-2-hAng1/VEGF165组，每只实验动物右下肢注射AAV-2-hAng1/VEGF165，2 mL。rAAV-2-LacZ组对每只实验动物左上肢注射AAV-2-LacZ，2 mL。对AAV-2-hVEGF165组每只实验动物左下肢注射AAV-2-hVEGF165，2 mL。注射部位用无损伤丝线缝扎肌膜做标记。

1.2.4 肉眼观察 注射AAV-2病毒4周后，将各组实验动物用氯氨酮按2 mg/kg进行肌肉注射麻醉后，取结扎丝线处切开皮肤及皮下组织，对比观察携带不同基因的4种AAV-2病毒对缺血肢体血管再生效应。

1.2.5 组织学检测 将麻醉的实验动物，取丝线结扎标记的肌组织，冰冻切片，厚度7 m，利用针对-SMA的一抗进行免疫组化染色，随机选取30个视野计数-SMA阳性的血管密度（-SMA阳性血管数/mm2）。

1.3 统计学处理 使用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，组内比较采用t检验，组间参数的比较采用单向方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肉眼观察4种AAV-2病毒分别对缺血肢体血管再生效应 AAV-2肌注实验动物4周后，依次循丝线缝扎处切开皮肤肉眼直视下观察注射带有不同基因的4种不同病毒的血管再生效果，结果发现注射同时携带有人hAng1/VEGF165基因的病毒其再生血管丰富密集且管径粗大，携带有人VEGF165基因的病毒再生血管稀疏且周围组织水肿明显，携带有人Ang1基因的病毒再生血管稀少，携带有人LacZ基因的病毒几乎无再生血管，见图1。

2.2 组织学检测血管再生效应 實验动物4周后肌组织切片经-SMA免疫组化染色，可见血管平滑肌染成了棕色如图2所示。-SMA阳性血管密度计数发现AAV-2-hAng1/VEGF165组为（9.8±5.2）个/mm2组明显高于AAV-2-hVEGF165组（6.2±3.0）个/mm2、AAV-2-hAng1组（5.1±2.1）个/mm2（t=4.21、5.96，P<0.05）、AAV-2-LacZ组（1.8±0.2）个/mm2（t=11.46，P<0.05）；AAV-2-hVEGF165组、AAV-2-hAng1组-SMA阳性血管密度计数均高于AAV-2-LacZ组（t=6.35、4.98，P<0.05）。

3 讨论

随着人民生活条件的好转，饮食结构的改变，人均寿命的延长等社会人口老年化的发展，使得缺血性血管疾病如冠心病，动脉硬化闭塞症，糖尿病足、血栓闭塞性脉管炎等为代表的疾病日益增多，严重影响人民的生活质量，部分还威胁到生命。文献[9]记载，在我国动脉缺血性疾病其总发病率为0.74%，是血管外科常见病。目前外科治疗对于广泛的动脉狭窄和闭塞病症没有很好的疗效，随着对缺血性疾病的深入研究，以及分子生物学和遗传学的进展，基因治疗在血管疾病治疗中是备受瞩目的新方法，利用转基因技术刺激缺血部位生长新生血管成为治疗缺血性血管疾病的一种主要措施[10]。

目前对于严重缺血性疾病的基因治疗，是使用病毒载体、非病毒载体或质粒载体将VEGF直接转染到缺血组织中或注射到血管内，利用细胞旁分泌VEGF的途径，促进病变部位侧支血管的建立[11-20]。

本研究用携带人VEGF165基因的病毒载体AAV-2-hVEGF165，携带人Ang1基因的病毒载体AAV-2-hAng1，携带-半乳糖苷酶（-gal）基因的rAAV-2-LacZ和同时携带人Ang1/VEGF165基因的病毒载体AAV-2-hAng1/VEGF165直接注射新西兰雄性大白兔缺血的四肢肌组织中，4周后利用肉眼观察和免疫组织化学法检测它们之间的血管再生效应。从本实验可以看出同时携带两种基因AAV-2在肌组织中高效表达，发挥最强的血管再生效应，单独携带人Ang1、VEGF16两种基因的AAV-2在肌组织也具有促进血管再生效应。因此，hAng1/VEGF165可协同性地促进缺血肢体的血管生成、动脉生成、血流量的恢复，并可能具有改变血管通透性的作用，其可能作为血管再生相关疾病的新的治疗方法，具有潜在的广泛的临床应用前景。

参考文献

[1] Salaru D L，Arsenescu-Georgescu C，Chatzikyrkou C，et al.

Midkine， a heparin-binding growth factor， and its roles in atherogenesis and inflammatory kidney diseases[J].Nephrol Dial Transplant，2016，31（11）：1781-1787.

[2] Chen C K，Yu W H，Cheng T Y，et al.Inhibition of VEGF165/VEGFR2-dependent signaling by LECT2 suppresses hepatocellular carcinoma angiogenesis[J].Sci Rep，2016，6（2）：31398-31409.

[3] Jarmul J，Pletcher M J，Hassmiller L K，et al.Cardiovascular Genetic Risk Testing for Targeting Statin Therapy in the Primary Prevention of Atherosclerotic Cardiovascular Disease： A Cost-Effectiveness Analysis[J].Circ Cardiovasc Qual Outcomes，2018，11（4）：e4171-e4195.

[4] Guyot M，Pages G.VEGF Splicing and the Role of VEGF Splice Variants： From Physiological-Pathological Conditions to Specific Pre-mRNA Splicing[J].Methods Mol Biol，2015，1332（1）：3-23.

[5] Tarallo V，De Falco S.The vascular endothelial growth factors and receptors family： Up to now the only target for anti-angiogenesis therapy[J].Int J Biochem Cell Biol，2015，64（9）：185-189.

[6] Shyu K G，Manor O，Magner M，et al.Direct intramuscular injection of plasmid DNA encoding angiopoietin-1 but not angiopoietin-2 augments revascularization in the rabbit ischemic hindlimb[J].Circulation，2014，98（19）：2081-2087.

[7] Zhao M，Yu Z，Li Z，et al.Expression of angiogenic growth factors VEGF， bFGF and ANG1 in colon cancer after bevacizumab treatment in vitro：A potential self-regulating mechanism[J].Oncol Rep，2017，37（1）：601-607.

[8] Park J，Kim J Y，Hwang S R，et al.Chemical Conjugate of Low Molecular Weight Heparin and Suramin Fragment Inhibits Tumor Growth Possibly by Blocking VEGF165[J].Mol Pharm，2015，12（11）：3935-3942.

[9] Kazemi M，Carrer A，Moimas S，et al.VEGF121 and VEGF165 differentially promote vessel maturation and tumor growth in mice and humans[J].Cancer Gene Ther，2016，23（5）：125-132.

[10] Zarbin M A.Anti-VEGF Agents and the Risk of Arteriothrombotic Events[J].Asia Pac J Ophthalmol，2018，7（1）：63-67.

[11] Gremmels H，Teraa M，Quax P H，et al.Neovascularization capacity of mesenchymal stromal cells from critical limb ischemia patients is equivalent to healthy controls[J].Mol Ther，2014，22（11）：1960-1970.

[12] Ryu J K，Cho C H，Shin H Y，et al.Combined angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor gene transfer restores cavernous angiogenesis and erectile function in a rat model of hypercholesterolemia[J].Mol Ther，2016，13（4）：705-715.

[13] Hou J，Wang L，Wu Q，et al.Long noncoding RNA H19 upregulates vascular endothelial growth factor A to enhance mesenchymal stem cells survival and angiogenic capacity by inhibiting miR-199a-5p[J].Stem Cell Res Ther，2018，9（1）：109-120.

[14] Shin S H，Lee J，Ahn D G，et al.Co-delivery of vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 using injectable microsphere/hydrogel hybrid systems for therapeutic angiogenesis[J].Pharm Res，2013，30（8）：2157-2165.

[15] Wang C，Zhang B，Lin Y，et al.Effects of Adenovirus-mediated VEGF165 Gene Therapy on Myocardial Infarction[J].Ann Clin Lab Sci，2018，48（2）：208-215.

[16] He L，Liu C，Sun C，et al.Wu-Tou Decoction Inhibits Angiogenesis in Experimental Arthritis by Targeting VEGFR2 Signaling Pathway[J].Rejuvenation Res，2018，12（5）：706-713.

[17] Jain A，Kratimenos P，Koutroulis I，et al.Effect of Intranasally Delivered rh-VEGF165 on Angiogenesis Following Cerebral Hypoxia-Ischemia in the Cerebral Cortex of Newborn Piglets[J].Int J Mol Sci，2017，18（11）：273-280.

[18] Galli F，Artico M，Taurone S，et al.Radiolabeling of VEGF165 with 99mTc to evaluate VEGFR expression in tumor angiogenesis[J].Int J Oncol，2017，50（6）：2171-2179.

[19] Quan R，Du W，Zheng X，et al.VEGF165 induces differentiation of hair follicle stem cells into endothelial cells and plays a role in in vivo angiogenesis[J].J Cell Mol Med，2017，21（8）：1593-1604.

[20] Feng Q，Zhang C，Lum D，et al.A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis[J].Nat Commun，2017，8（1）：14450-14466.

（收稿日期：2018-07-09） （本文編辑：周亚杰）