PD-1在弥漫大B细胞淋巴瘤的表达及对CD8+T细胞功能影响的研究

王彤彤 李建虎 钱素英 郑翠苹 方丽娟 童向民⋆

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）占非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma NHL）的30%～40%［1］，半数以上患者确诊时已处于晚期并伴有多器官转移，病死率较高［1］。研究表明，肿瘤的发生发展与免疫逃逸密切相关，主要机制在于T细胞的功能缺陷，肿瘤通过抑制免疫细胞活性或诱导免疫耐受发挥免疫逃逸。程序性死亡分子-1（programmed death-1，PD1）主要在活化的T细胞上表达，作为T细胞膜上的一种跨膜糖蛋白，因与细胞凋亡相关而得名。PD-1与其配体PD-L1（programmed death ligand）信号通路可通过特异性抑制CD8+T细胞活性，负向免疫调节T细胞功能，使肿瘤细胞发生免疫逃逸［2］。本实验主要研究DLBCL组织中PD-1的表达情况，及其对T细胞比例的影响。报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料及设备 （1）DLBCL及正常淋巴组织：组织来源于2017年6月至2018年2月浙江省人民医院经手术切除的诊断明确的DLBCL患者肿瘤标本及瘤周正常淋巴组织标本，所选取的患者术前均未接收过放化疗。（2）主要抗体：PD-1鼠单克隆抗体购于美国CST公司；β-actin抗鼠单克隆抗体购于中国上海碧云天公司；流式抗体CD4（PE-cy7）、CD8（Pacific Blue）、PD-1（Percp）、IFN-γ（Alexa Fluor 700）、IL-2（Alexa Fluor 700）来源于eBioscience公司（美国）。（3）主要仪器：FACSCalibur流式细胞仪来自于BD公司（美国）；成像系统VesorDoc-5000和DY-A型电泳仪来自于Bio-Rad公司（美国）。

1.2 实验方案 分组：IPI＜2分的DLBCL组织31例，IPI＞2分的DLBCL组织23例，瘤周正常淋巴组织14例。实验方法：（1）流式细胞术分析：取DLBCL组织及瘤周正常组织，生理盐水洗涤后，用刀切成1.00mm的小块，加入胶体酶37℃过夜，280目筛网过滤，离心去上清液，下层及单细胞细胞团，用PBS重悬。调整单细胞悬液浓度稀释为1×106/ml，以1μl/ml的比例加入细胞因子染色刺激剂和细胞因子释放阻断剂Golgi Plug、Golgi Stop。加入IFN-γ和IL-2抗 体各3μl，孵育30min，缓冲液洗涤一次，1%多聚甲醛固定10min后上机检测。（2）Western Blot检测：在10例新鲜DLBCL组织及瘤周正常组织，加入裂解液RIPA（购于中国上海碧云天公司），之后利用组织研磨机（购于中国上海静信科技公司）研碎样品、离心取上清液，采用BCA蛋白浓度测定法（购于中国上海碧云天公司）将蛋白定量，取20μg蛋白样品进行电泳，后转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2h加入一抗（PD-1抗体稀释比例按1∶1000），4℃摇床孵育过夜。TBST漂洗3次，后浸于1∶3000稀释的二抗中，室温摇床上孵育1h，TBST漂洗后行ECL显影。利用VesorDoc-5000成像系统进行曝光成像。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，同例患者不同标本间的比较采用配对t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot分析DLBCL组织及正常淋巴组织中PD-1的表达差异 DLBCL组织及正常淋巴组织均表达PD-1分子，且肿瘤组织PD-1的表达水平高于正常组织（见图1、2）。

2.2 流式细胞术检测DLBCL及正常淋巴组织中PD-1+CD8+T细胞的表达水平 PD-1+CD8+T细胞在IPI＜2分的DLBCL组织中的比例（12.23±0.85）%明显高于正常淋巴组织（3.91±0.41）%，P＜0.01；IPI＞2分的DLBCL组织PD-1+CD8+T细胞的比例（31.79±0.87）%明 显 高 于IPI＜2分 的 瘤 组 织（12.23±0.85）%，P＜0.01。

2.3 流式细胞术检测正常淋巴组织及DLBCL中IFN-γ/IL-2双阳性的表达 在正常淋巴组织中PD-1+CD8+T细胞双阳性IFN-γ/IL-2表达比例和PD-1-CD8+T细胞中无显著性差异，P＞0.05；在DLBCL组织中PD-1-CD8+T细胞较PD-1+CD8+T细胞表达较多的双 阳 性IFN-γ/IL-2，P＜0.01；且IPI＞2分 的DLBCL组织中PD-1+CD8+T细胞比IPI＜2分的DLBCL组织中PD-1+CD8+T细胞表达的IFN-γ/IL-2更低，P＜0.01（见表2）。

图1 （1，4，10 为IPI＞2分的DLBCL组织；2，5，7，8为IPI＜2分的DLBCL组织；3，6，9为正常淋巴组织）。

图2 各组织的蛋白表达水平

表2 不同类别组织中IFN-γ/IL-2双阳性的表达（%）

3 讨论

PD-1在正常组织中几乎不表达，但是在多种原位肿瘤的细胞膜上大量表达，如直肠癌、 乳腺癌等，且与肿瘤的大小、分级及转移情况密切相关［3］。PD-1主要表达在活化的T细胞上，PD-1分子内含有2个酪氨酸，与配体结合后均可发生磷酸化，其中在C端的ITSM的磷酸化是维持PD-1抑制T细胞功能的必要条件［4］。磷酸化后ITSM可以招募SHP-2和SHP-1，阻断下游通路的激活，进一步影响物质代谢，使细胞因子（IL-2）分泌减少，使T细胞结构紊乱，功能枯竭，造成T细胞活动通路无法激活［5］，最终导致肿瘤细胞免疫逃逸，引起疾病进展。Mu CY等［6］通过免疫组化对109例非小细胞肺癌患者样本进行多变量分析，得出结论：PD-1低表组的总体生存率明显高于PD-1高表组。本文通过一系列实验发现IPI＞2分的患者较IPI＜2分的患者PD-1高表达，IPI＜2分的患者较正常组织PD-1高表达，差异具有统计学意义，与文献结论一致。

在本资料中，作者通过一系列实验发现，在DLBCL进程中，PD-1表达的增高，抑制T细胞中IFN-γ/IL-2双阳性表达。但也有文献表明［7］IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6与NHL均不相关。与本文的实验结果有一定的偏差。但上述文献纳入研究的病例除DLBCL之外，还有其他类型的NHL，如滤泡性淋巴瘤、T细胞淋巴瘤等，与本文纳入标准不统一，结论可能因此会有偏差。

综上所述，PD-1在DLBCL中的高表达以及对T细胞免疫功能的影响，具有较高的临床意义，为DLBCL的免疫治疗提供新思路和临床依据。