胸膜穿刺针联合OB吻合胶构建615小鼠胃癌皮下移植瘤模型*

程 诚 曾永蕾 王 茎 吴 勇 冷玉玲孙 春 臧刘兵 尹亚男 刘 青

(1. 安徽中医药大学，合肥 230001)(2. 安徽中医药大学第二附属医院，合肥 230061) (3.安徽中医药大学中医学院，合肥 230038)

胃癌是全球高发的消化道恶性肿瘤之一，在亚洲范围内更为显著，我国平均每年新增约40万余例病人，是世界总发病例数的42%。从2005年开始，胃癌已经成为中国癌症发病率和死亡率第一的恶性肿瘤[1]。可见，胃癌已经严重危害了我国人民群众健康。因此，进一步研究胃癌的发病机制及探索新的治疗方法，建立一种准确高效的胃癌动物模型具有非常重要的意义。目前常用裸鼠建立胃癌动物肿瘤模型，但是裸鼠存在免疫缺陷，这对研究免疫功能产生了难度[2-4]。615小鼠属于免疫功能正常的小鼠，且对胃癌细胞亲缘性较好，为了更好地研究免疫功能，故采用615小鼠建模。现拟采用胸膜穿刺针结合OB吻合胶粘贴法建模[5]，通过小鼠前胃癌细胞株(Mouse Forestomach Carcinoma Cell，MFC)来成功构建615小鼠胃癌皮下移植瘤模型。本研究旨在为建立准确高效的胃癌动物模型提供方法支持。

1 材料与方法

1.1 基本材料

胸膜穿刺针(上海埃斯埃医械塑料制品有限公司，规格：2.0×65)；OB医用吻合胶(广州白云医用胶有限公司，批号：160108)；10 cm眼科剪，10 cm眼科镊，碘伏，棉签均购自合肥摩尔生物科技有限公司；小鼠前胃癌细胞株(Mouse Forestomach Carcinoma Cell，MFC)购自武汉普诺赛生物科技有限公司。

1.2 实验动物

无特定病原体(SPF)级615小鼠，6～8周龄，雌雄各半，体质量(24±2)g，购自安徽中医药大学动物实验中心，生产许可证：SCXY(皖)2014-0009。615小鼠养殖于安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室动物房。

1.3 试剂

多聚甲醛(天津市光复精细化工研究所，含量不少于95%，规格：500 g/瓶，批号：20160617)。

1.4 仪器

脱水机(武汉俊杰电子有限公司型号：JJ-12 J)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司 型号：JB-P5)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司 型号：JB-P5)；冻台(武汉俊杰电子有限公司 型号：RM2016)；组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 型号：JB-L5)；烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司 型号：KD-P)；载玻片(Servicebio)；正置光学显微镜(日本尼康 型号：Nikon Eclipse E100)；成像系统(日本尼康 型号：Nikon DS-U3)。

1.5 方法

1.5.1小鼠模型构建：(1)MFC细胞的培养及传代 用含10%胎牛血清+90%培养基+1%双抗培养MFC小鼠前胃癌细胞，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中，隔2 d换液，待细胞长满培养皿约90%时，按1∶3传代于新培养皿中，放入恒温培养箱中培养。

(2) 615小鼠胃癌皮下移植瘤的模型构建 在无菌操作台下收集MFC小鼠前胃癌细胞，制备成浓度为1×107个/mL的细胞悬液。碘伏消毒两只615小鼠右腋下，1 mL注射器分别抽取0.2 mL细胞悬液注射进两只小鼠右腋下。每天观察，待瘤体长至直径1 cm时，准备下一步实验。

(3)615小鼠胃癌皮下移植瘤的传代 选择一只成瘤小鼠处死[6]，将小鼠放于酒精里浸没消毒，剥离肿瘤组织，清除包膜纤维、血管及坏死组织，然后放于PBS缓冲液中清洗干净，正常的肿瘤组织，呈淡红色鱼肉状。选取外观形态较好的瘤体，剪成直径约1 mm的小瘤块备用。选取3只生长状态良好的615小鼠，禁食12 h，以0.3%戊巴比妥钠(0.2 mL/10 g)进行腹腔麻醉，固定小鼠于手术操作台上，碘伏消毒小鼠右上肢腋窝处，拿出胸膜穿刺针(为套管针，结构分为两个部分，一部分是外针管，一部分是内推杆)，操作时把推杆往后抽，空出针的前段部分，将备好的小瘤块用眼科镊子夹起从针头方向塞入针内，刺入右腋皮下，进针深度控制在0.5～0.7 cm，推动推杆到底，随后用OB吻合胶粘合腋下针孔。每天观察，当瘤体长至直径为1 cm时脱颈处死小鼠，按以上方法在体内传代三次。第三次取出肿瘤，作为模型组移植瘤源。

(4)615小鼠胃癌皮下移植瘤模型的建立 将移植瘤源剪成直径约1 mm的瘤块备用[7]。选取生长状态良好的615小鼠20只随机分成两组，禁食12 h。模型组按上述方法建模，对照组除不放入瘤块，其余步骤方法与模型组一致。隔天测一次小鼠体质量，每24 h观察小鼠右腋下皮肤，以判断体质量变化及成瘤情况。每三天用游标卡尺测量肿瘤大小，按公式V=π/6×长×宽×高，计算肿瘤大小，并绘制生长曲线。

1.5.2处理动物:观察21 d后处死615小鼠，剥离出肿瘤组织，瘤块称重。标本浸于4%多聚甲醛中保存，然后石蜡固定，最后进行HE染色。HE染色后，显微镜镜检，图像采集分析[8]。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 小鼠体质量变化情况

从造模起始，隔3天取小鼠平均体质量值，绘制小鼠体质量随时间变化曲线(图1)。起始时，对照组和模型组体质量无明显变化，7 d后，两组小鼠体质量发生不同变化，其中对照组体质量增长12.84%，模型组体质量下降3.59%(表1)。因肿瘤细胞会消耗机体的大部分能量，进而导致体质量下降，间接地证明了模型组造模成功。

图1 两组小鼠体质量变化情况Fig.1 body weight changes in the two groups of mice

组别group动物数量/只Animal quantity体质量/gbody Weight/g测量开始Measurement start测量结束End of measurement体质量增加/%Weight gain/%对照组False model group1024.62±2.0227.78±1.5112.84模型组Model group1024.51±1.5223.63±1.93-3.59

2.2 肿瘤生长状况

3～5 d潜伏期后，接种部位皮下可见灰白色结节，后呈圆形或椭圆形生长，每3天测量一次肿瘤体积大小(表2)。绘制肿瘤生长曲线(图2)。肿瘤在第12天后生长较快,前期生长较慢，成功率为100%。

表2 肿瘤体积

图2 肿瘤生长曲线Fig.2 the growth curve of the tumor

2.3 外观形态和解剖观察

皮下移植瘤10 d可长至直径1 cm大小，生长迅速，可作为小鼠瘤源，进行皮下移植。模型组10只小鼠在皮下移植21 d后，均可在右腋下触及肿块(图3)。经解剖发现，10只615小鼠全部成瘤，成瘤率为100%。肿瘤组织呈肉红色，表面不均匀呈结节状，触之较硬。进一步观察，发现肿瘤组织多与皮肤粘连，并向胸膜浸润。对照组没有肿瘤生成。

图3 腋下肿块Fig.3 subaxillary mass

2.4 瘤重结果

如表3所示：10只模型组内的615小鼠接种21d后，平均瘤质量为(7.7160±0.2937)g，提示肿瘤生长大致相同，瘤质量差异较小(图4、5、6)。对照组无肿瘤生成，平均瘤质量为0 g，两组之间差异显著(P<0.01)。

表3 615小鼠平均瘤重Table 3 Average tumor weight in the 615 mice

注：与对照组组比较*P<0.01

Note：compared with the control group,*P<0.01

图4 腋下移植瘤Fig. 4 axillary transplantation tumor

图5 腋下移植瘤Fig.5 axillary transplantation tumor

图6 腋下移植瘤Fig.6 axillary transplantation tumor

2.5 病理结果

HE病理染色结果判读(细胞核呈蓝色，细胞质呈红色)。结果可见瘤块体积较大，表面不规则，外观粉红，切面灰白，呈鱼肉状，血供丰富，包膜较完整。细胞核呈圆形、卵形或异型，深染，大小不等，形状不一，排列不规则，核仁不显现， 核分裂相较明显，是比较典型的胃癌组织的形态特征。如图7。

图7 肿瘤组织HE染色结果(×400)Fig.7 HE staining (×400)

3 讨论

常见的人胃癌裸鼠移植瘤造模有细胞接种法和匀浆法，这两种造模方法对细胞浓度及细胞质量要求较高，在操作过程中，易造成细胞死亡，成瘤率低，瘤块差异大[9]。然而采用胸膜穿刺针联合OB吻合胶构建615小鼠胃癌移植瘤模型，该方法操作相对简单，伤口小，速率快，成瘤率高，恢复快，瘤块差异小。本研究所建立的造模方法为今后研究相关实验动物移植瘤模型的构建标准提供了较为可靠的数据。

实验选择近交系615小鼠作为实验动物移植瘤模型的构建，不但因为其生命力顽强，饲养简单，而且它的遗传稳定性保证了接种成功率，它比裸鼠简单经济，比普通小鼠稳定[10]。裸鼠是免疫缺陷动物，必须生存在SPF环境中，其价格昂贵[11]。体质量小，发育缓慢，生长周期长，建模周期长(4～5周)。与615小鼠的2～3周相比，裸鼠建模太过漫长。MFC细胞系是来源于小鼠前胃癌的上皮肿瘤细胞系，而且仍然保持着原来615小鼠前胃癌自发血道转移的特性[12]，因此小鼠前胃癌细胞株(MFC)与615小鼠有较好的亲缘性，是其良好的宿体。因此，MFC细胞系被选为615小鼠移植瘤的模型。

实验过程中的注意事项：为确保穿刺针在皮下顺利刺入，皮肤应尽量平展，避免紧绷，接种时进针点下移约1 mm，针头在皮下移动一段再缓慢注射。注射前活动针头，如能活动表明针头在皮下，即可避免穿入胸腔造成小鼠死亡，否则会导致瘤块与胸膜粘连而使瘤块剥离困难。鉴于OB吻合胶在潮湿情况下易催化成固体，因此在植入瘤块前需要尽量减少瘤块湿度及渗液，来减少OB吻合胶与组织粘连。同时需要注意，615小鼠生性比较凶猛，易互相打斗相残，造模后应加强护理(雌雄小鼠分笼饲养，性情凶猛的单笼饲养，备足饲料及饮水，饲养环境要保证光线充足)，如此可有效避免打斗相残及不必要的死亡。

实验中的问题：瘤块接种时会出现肿瘤生长不均匀的情况，除因为针管不够光滑导致瘤块挂针外，还因为瘤块准备过程中的不当操作，很难保证每个小鼠的肿瘤大小相同，这些接种过程中的微小差异可以在成瘤后产生巨大差别。为了尽量减小此类差异，需仔细挑选光滑针管，并用细小瘤块反复测试针管。为了避免瘤块大小不一，先用精准标尺把肿瘤组织切成厚度为1 mm的组织切块若干份，选取切面面积较大的切块，然后用精准标尺在切块上每1 mm宽度标记一个位置，再用手术刀精准切开组织成条形，选取切面均匀的条形，再按1 mm宽度切成块状，选出切面均匀的瘤块作为实验瘤块，放入培养基里以保证肿瘤细胞活性，如此可大幅度地减少差异。众所周知，肿瘤转移是一个复杂的过程，肿瘤细胞或者肿瘤组织在小鼠体内被接种后，能否发生转移，除与接种途径和接种位置有关外,还与肿瘤组织的分化程度、小鼠的生理状态有关。另外，小鼠如果受细菌、病毒等感染时,还会增强抗原刺激，进而使NK细胞等非T细胞依赖性免疫活性受到影响，最后导致移植肿瘤的成活率及转移发生率也受到影响。处理好这些问题，不但需要增加样本统计、严格执行随机分组的实验原则，还更加需要科研人员具备严谨的科学态度，并且尽可能减少人为误差，这样建立实验模型才能更符合预期目标[13]。