柯萨奇A组16型对不同细胞的敏感性研究*

王永菲 于 伟 朱晓伟

(1. 内蒙古医科大学实验动物中心，呼和浩特 010110)(2. 辽宁省疾病预防控制中心， 沈阳 110005)

最新统计显示，手足口病是世界范围内常见的儿童流行传染病，以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要特征。手足口病可由20多种病毒感染引起，其中柯萨奇A组16型和人肠道病毒71型是主要病原体。 人肠道病毒71型(Human Enterovirus71， HEV71)感染5岁以下的儿童导致 手足口病时，会出现比较严重的并发症，包括呼吸系统并发症(如急性肺水肿、急性肺出血甚至发展为心肌炎等)和神经系统并发症(如脑干脑炎、无菌性脑膜炎和类脊髓灰质炎样麻痹等)[1-2]，预后不良，因此对 HEV71型的研究就较多较深入； 而柯萨奇A组16型(Coxsackievirus A16，CVA16)儿童感染后通常不引起严重的中枢神经相关的疾病，因此对CVA16型的研究较少，但近几年越来越多的研究表明，CVA16感染与心肌炎、心包炎及其他严重疾病相关[3]，尤其在我国自主研发的HEV71疫苗上市后，儿童可以通过预防接种达到90%以上的免疫保护，因此在临床上CVA16型相较而言成为了引起儿童手足口病的主要病原体。尽管因感染CVA16而引起的重症患者没有HEV71多，但是由于感染CVA16型而导致的手足口病患者的数量并不是少数，基本上占患者总数的三分之一左右，由此引发的医疗的投入还是相当可观的，所以对CVA16的分离及检定也需要加以重视。

病原分离是疫情判定的金标准，而对于病毒病来说想要分离到病原，其中最重要的是要筛选到敏感的细胞系[3-4]。本研究将核酸检测CVA16为阳性的标本，分别在二种细胞系中进行病毒分离，通过统计不同细胞系的分离率来比较不同细胞对阳性样本的敏感性，从而确定肠道病毒CVA16的最敏感细胞，建立快速准确的病毒分离方法，为临床的对症治疗提供依据，而且通过对病毒的变异分析，为制定有效防控儿童手足口病措施提供有力的科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本的采集和处理

随机抽取辽宁各市送的手足口病临床诊断患者咽拭子标本20份，化冻后每个标本分为3份，分别装在3支冻存管中。1支用于核酸提取并进行Real-time PCR 检测，一支用于实验室备查留样，另一支用于细胞筛选病毒分离，后二支样品放置于-70 ℃冰箱冻存。

1.2 病毒分离鉴定

选取二种细胞进行病毒分离，分别是人横纹肌肉瘤细胞(RD)、非洲绿猴肾细胞(VERO)，细胞均为辽宁省疾病预防控制中心细胞库保存。MEM为美国Gibco/Life technologies公司生产；胎牛血清、0.25%胰酶及双抗均为以色列Biological Industries公司生产。每份标本在二种细胞上至少传三代，如果出现致细胞病变效应(CPE)，则判为阳性；如果不出现CPE，则判定为阴性。无论是否有CPE出现，均将所有病毒培养液全部收集，使用荧光定量PCR(Real-time PCR)方法进行下一步鉴定。

1.3 病毒核酸提取

实验采用 QIAGEN 公司的EZ1 Advanced XL 全自动核酸提取仪，使用EZ1 Virus Mini Kit V2.0(Cat. No.955134)进行核酸提取，具体步骤参考其说明书。

1.4 病毒核酸检测

将提取的核酸应用Real-time PCR检测方法，扩增反应体系配备和条件按照说明书操作和设置。检测试剂盒为江苏硕世公司的肠道病毒通用型核酸监测试剂盒(荧光PCR法)及江苏硕世公司的柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒(荧光PCR法)；PCR仪为ViiATM7荧光定量PCR。

2 结果

2.1 标本的核酸检测结果

2.1.1对20份标本肠道病毒用通用型核酸监测试剂盒(荧光PCR法)进行肠道病毒通用型检测，试剂盒中自带质控参考品，包括阴性参考品和阳性参考品，结果判定标准是：阳性，CT≤35且曲线呈S型；阴性，CT>38或者未检出。检测结果如下：

如图1，显示21条典型的S型阳性曲线，其中所示1条为阳性对照，其余20条均为阳性标本，所抽取的20份标本的 CT值小于35，可以确定此次标本全部为肠道病毒阳性标本。 这20份标本是各市所送的阳性标本，此结果与各市的检测结果完全一致。

2.1.2对肠道病毒阳性的标本用柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒(荧光PCR法)进行CVA16型检测，试剂盒中自带质控参考品，包括阴性参考品和阳性参考品，结果判定标准是：阳性，CT≤35且曲线呈S型；阴性，CT>38或者未检出，检测结果如下：

如图2，显示10条典型的S型阳性曲线，其中所示1条为阳性对照，其余9条均为阳性标本，9份标本的CT值小于35，可以确定为肠道病毒CVA16阳性标本，其他的11份标本为非CVA16的肠道病毒阳性标本。

图1 所抽取的 20份标本的肠道病毒通用型Real-time PCR检测结果Fig.1 Detection of 20 specimens by universal enterovirus Real-time PCR

图2 标本编号01、04、05、09、10、13、14、17、20的肠道病毒CVA16型Real-time PCR检测结果Fig.2 01、04、05、09、10、13、14、17、20 specimens by enterovirus CVA16 Real-time PCR

2.2 病毒分离

实验选用了二种细胞进行病毒分离，分别是人横纹肌肉瘤细胞(RD)、非洲绿猴肾细胞(VERO)，将9份确定的阳性标本分别接种到细胞中，每个阳性样本在二种细胞上至少传三代， RD细胞中4份标本出现了明显的CPE，可观察到细胞变圆、皱缩至脱落的病变，5份样本没出现病变；VERO细胞中有8份标本出现了明显的 CPE，可观察到细胞肿胀、变圆、聚集成葡萄串状的病变，1份样本没出现病变。仅就细胞病变而言，发生病变的VERO细胞与正常的VERO细胞在形态上有很大的改变，更直观、更便于观察；RD细胞的细胞病变不易观察，其病变与细胞衰老的状态相似，需要仔细辨别和经验积累。

图3 左图为正常Vero细胞，右图是出现CVA16阳性标本病变的Vero细胞Fig.3 The left image is normal Vero cell,the right picture is Vero cell with CVA16

图4 左图为正常RD细胞 右图是出现CVA16阳性标本病变的RD细胞Fig.4 The left image is normal RD cell,the right picture is RD cell with CVA16

2.3 病毒培养液的核酸检测结果

当实验进行到阳性样本在细胞上培养三代时，分别抽取病毒培养液，用柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒(荧光PCR法)进行CVA16型检测，试剂盒中自带质控参考品，包括阴性参考品和阳性参考品，结果判定标准是：阳性，CT≤35且曲线呈S型；阴性，CT>38或者未检出，检测结果如下：

如图5，显示共有15条典型的S型阳性曲线，其中1条为阳性对照，其余14条为阳性病毒培养液，这14条曲线的 CT值均在20左右小于35，可以确定为CVA16病毒阳性。RD细胞的病毒培养液，6份标本结果为阳性，其中2份为细胞培养没出现明显的CPE的标本的结果也是阳性，其余3份标本结果为阴性；VERO细胞的病毒培养液，8份标本结果为阳性，1份标本结果为阴性。以上结果表明用 RD细胞分离CVA16时，需要将全部病毒培养液进行核酸检测，才能确保没有遗漏的阳性病毒液；而用VERO细胞分离CVA16时，只需要认真观察细胞病变就可以判定是否为阳性，这样不仅节省了试剂，也减少了实验人员的工作量。

图5 病毒培养液的Real-time PCR检测结果Fig.5 Detection results of Real-time PCR in virus culture fluid

3 讨论

自从1951年在南非分离到CVA16以来，其流行范围已遍布全球。不同基因型或基因亚型的HFMD交替爆发于东亚和东南亚地区[5-6]。从辽宁省各年检测的HFMD 送检样本结果可知，近几年来辽宁省HFMD 主导病原型别存在交替变化，2012 年、2014 年、2016 年HFMD 主导病原学型别以CVA16 为首[7-8]，分别占当年检测阳性数的50%左右；2013 及2015 年HFMD 主导病原学型别以其他肠道病毒为首，分别占当年检测阳性数的50%左右。从这组数据可以看出，CVA16型作为辽宁省近几年手足口病的优势株，对辽宁省儿童健康造成的危害还是不容小觑的。

分离毒株主要是为了基因序列测定分析等相关研究，而能够引起手足口病的肠道病毒有20多种，不同的病毒对不同细胞系的敏感性不尽相同，为了获得更多型别的肠道病毒，我们要采用尽可能多的细胞系进行病毒分离，来获得更多的毒株进行研究，以便能够更真实地了解当地手足口病的病原谱[9-12]。同时一种病毒对不同的细胞系的敏感性也不同，我们也要采用尽可能多的细胞系进行病毒分离，从中确定其最敏感的细胞系，以提高病毒的分离率，降低分离成本。

本实验选取二种细胞对肠道病毒CVA16型进行分离：人横纹肌肉瘤细胞(RD)、非洲绿猴肾细胞(VERO)。结果表明在VERO细胞上肠道病毒CVA16型敏感性最高，而且在 VERO细胞上病变明显，容易直接观察到，可以根据所观察到的 CPE进行核酸检测，基本上不会漏检；其次是 RD细胞，但CVA16型在 RD细胞上病变不明显，病变与细胞老化非常接近，所以在观察细胞病变时不仅要及时还要有一定的工作经验，否则要全部进行核酸检测，增加病毒分离及鉴定的成本。综上所述，VERO细胞和RD细胞均是肠道病毒CVA16的敏感细胞，但RD细胞如果仅凭CPE判断容易发生漏检，而且其敏感性也不如VERO细胞，因此我们认为VERO细胞是分离肠道病毒CVA16型的首选细胞。

现阶段手足口病毒的细胞筛选多选用VERO细胞和RD细胞，这两种细胞都是传代细胞，具有易培养、生长快的优点[13-14]。RD细胞是人横纹肌肉瘤细胞，本身具有致肿瘤性，不能用于疫苗的生产；VERO细胞是非洲绿猴肾细胞，在有限的代次内无致肿瘤性，在国内已经被广泛应用于疫苗生产。手足口病 HEV71型疫苗就是以VERO细胞为培养基质研制成功的，但国内尚未有比较CVA16型病毒的细胞敏感性的研究，通过本研究可以初步确定CVA16型对VERO细胞也较敏感，那么可以推测未来CVA16型疫苗也可能通过这种模型取得成功，如果该种疫苗研制成功，将会同 HEV71型疫苗一起有效地降低儿童手足口病的发病率。