CLARITY组织解剖技术及其发展现状

王满才 王向文 马玉婧 张 昕 魏振刚 张亚武 马建忠 徐小东 张有成

(兰州大学第二医院普外科, 兰州 730000)

在神经系统研究领域,为了实现从完整的生物组织中获得其详细的形态结构及分子信息,科学家们做出了长久不懈的尝试和努力,也因此带动了相关领域研究技术的革新[1-2]。传统方法中,为了达到以上目的,科研中采用最多最成熟的方法是组织切片和结构重建技术[3]。然而,该技术最大的缺点是大多数研究只能在极小范围的神经组织中进行,而切片会导致组织结构一定程度上的变形或破坏,同时所获得的组织信息仅为20～50μm 的厚度[3],即使是使用当前最先进的双光子显微镜,其可视厚度也不超过600～800μm[4],这极大地限制了对脑内一些物质分布不同脑区基因表达情况的研究,也完全不能满足从组织的整体水平研究其结构-功能相关性的需求,故在很大程度上限制了相关领域研究的进展。

现有技术的不足以及未来研究对新技术的需求,共同促使相关技术研究的发展和创新,出现了诸如SCALE[5]、CUBIC[6]、SeeDB[7]、PARA[2]及CLARITY[8-10]等一系列创新性技术的问世,其中CLARITY技术最具有全面优势和应用前景。

1 CLARITY技术的诞生

2013年5月,美国斯坦福大学的Chung等在《Nature》杂志上首次报道了一种名为“CLARITY”的全新脑组织形态和生物分子分析技术[8]。该技术不仅能使大脑变得透明可视,更重要的是,它能保证大脑中最重要的构成物质保持在原位,能在完整的脑组织原位呈现立体的神经突触与神经纤维投射网络、亚细胞结构,以及蛋白质、核酸和神经递质等生物分子的分布部位和精细空间结构[9]。该技术被称为是2013年全球最重要的科技进展[11],这一创举必将在很大程度上加速奥巴马总统提出的脑科学研究计划。

自该技术诞生以来,已有大量的研究对其进行了论证、应用及改良[4,12-13],在我国各大媒体及学者中也引起了广泛的关注。由于CLARITY技术起初主要是用于脑组织科学的研究,故此有研究者将其称之为“透明脑”技术。然而,随后的研究证明,该技术用于其他如肾、肝、胰、肺及肠等组织的研究完全可行[13],故此笔者认为将其翻译为“透明组织”技术更为合理。

2 CLARITY技术的基本原理[8-10]

细胞膜的主要框架结构为磷脂双分子层,也正是这些脂类的屏障作用影响了细胞乃至组织的通透性和透光性。CLARITY技术通过加热一种小分子凝胶样物质将组织中的重要生物分子如蛋白质、核酸和神经递质等牢牢地固定在原位,而将未固定的脂类通过电泳从组织中去除,从而实现最大可能的物质通透性及透光性。

2.1 水凝胶-组织混合物制备

首先,用事先准备好的水凝胶单体溶液(主要成分为丙烯酰胺、双丙烯酰胺、多聚甲醛及VA-044引发剂)对麻醉后的实验动物经心充分灌注,再将分离后的组织标本浸入4℃的水凝胶单体溶液中一定时间,最后将组织加热至37℃至凝胶单体完全聚合。在该过程中,丙烯酰胺纳米单体会逐渐渗透进入组织和细胞内。同时,多聚甲醛不仅能与含NH3+的生物分子(蛋白质、核酸及其他小分子等)发生交联,也能与凝胶单体进行共价结合,从而使得凝胶单体与生物分子之间形成了间接结合。在37℃条件下,凝胶单体会发生聚合反应,连同生物分子共同形成了一种稳定的网状结构的聚合性凝胶混合物。值得注意的是,在整个过程中,组织中的脂质成分均未参与以上聚合反应,因此为后续脂质的电泳提供了条件。

2.2 组织电泳[8,10]

在硼酸和十二烷基磺酸钠(SDS)缓冲液中,给上述水凝胶-组织混合物提供适宜的直流电压和温度,表面原本带有负电荷的SDS微团会随电场发生移动,将分布于组织及细胞中的脂质分子携带清除,而其他重要的功能性生物分子,如蛋白质等,则因网状结构的保护而固定在原来位置,其结构和数量基本保持完整不变。最后经过折射率(IR～1.45)与水凝胶相近的均质液(甘油或FocusClear等)处理后,从而制备出一种均质透明的组织模型。

CLARITY技术使组织透明后,除一些特殊的实验动物(如转基因荧光小鼠)其自身带有荧光信号外,可以对感兴趣的物质如蛋白质、核酸等进行后续的标记,研究者便可以在光学显微镜下直观地观察、研究组织中各个感兴趣区域相关分子的分布、表达、网络连接及投射关系等。

3 CLARITY技术的设备构成[3,8,10]

3.1 通风厨

实验中所使用的丙烯酰胺、双丙烯酰胺及多聚甲醛等均具有毒性,可对人体造成较大的损害,故所有相关的操作都应在通风厨中进行。同时在操作期间必须戴口罩、手套及穿防护衣,确保实验者安全。

3.2 氮气罐和干燥箱

氮气罐主要是提供氮气,用于置换组织标本及水凝胶液体中的氧气,有利于水凝胶液体发生充分的聚合;干燥箱主要用于提供密闭空间,配合氮源一起使用,可用密封较好的小动物麻醉箱等充当。

3.3 真空泵

用于充分抽尽干燥性的空气和氮气,提供绝对真空环境。

3.4 电泳装置

3.4.1 电泳槽 用于安装铂电极和电泳组织标本,可用耐脏的聚丙烯广口瓶充当。目前文献报道的主要有60ml(VWR,No.36319-547;Thermo Scientific, No. 2118-0002)[3,10]和125ml(Thermo Scientific, No.2118-0004)[10]2种规格。

3.4.2 铂电极 铂丝具有耐高温、高电压等特性,是充当电极的较好材料。但直径不能太细,容易被烧坏,推荐直径为0.5mm(Alfa Aesar, No.10286; Sigma-Aldrich,no.267201-2G)[3,10]。

3.4.3 标本架 用于电泳过程中组织标本的固定,可用细胞过滤网充当。

3.4.4 耐高温网 配合样品架用于组织标本的固定,同时防止标本与电极接触,避免烫伤损坏。

3.4.5 分流器和过滤器 分别接于电泳槽两端,分流电泳缓冲液。目前文献中报道的主要有4通[10]分流和6通[3]分流。过滤器主要用于缓冲液的过滤,一端连接过滤器,另一端连接低温液体循环器。

3.4.6 低温液体循环器 用于控制电泳过程中缓冲液的流速和温度。

3.4.7 电压可控电源及适配器 用于提供电压,最好能同时提供多通道稳定电压(如Bio-Rad, PowerPac TM, No.164-5070)。

3.4.8 耐高温防水胶 主要用于各部件之间的黏合固定。

3.5 其他

试管、注射器、动物手术器械、不同规格塑料管及香蕉插头等。

4 CLARITY技术的优势

与传统的组织切片及重建技术相比,CLARITY技术用于组织结构及功能的研究具有明显的优势,具体表现如下：

4.1 克服了脂质对光线折射的影响,明显增加了光线穿透的深度[3,4,8,10,12]

传统的切片技术对标本的厚度具有苛刻的要求(20～50μm)[3],其主要是受普通显微镜可穿透深度的限制,即使是应用当前较为先进的双光子显微镜,其可视深度也在600～800μm[4]之间,仍很难满足当前研究的需求。而造成这种限制的根本原因除了显微镜方面的缺陷外,更主要是因为组织及细胞中的脂质分子对光线的折射作用所致。CLARITY技术通过电泳完美去除了脂质分子,降低甚至避免了其对光线的干扰,明显加深了光线的穿透深度。同时显微技术的进一步发展,将使得观察更深的组织空间结构成为现实。

4.2 降低了对组织结构和重要组成成分的破坏[3,10]

CLARITY技术通过多聚甲醛与丙烯酰胺/双丙烯酰胺以及组织内重要的生物分子之间形成了稳定的网状水凝胶结构,将这些重要的生物分子稳定地固定在原有位置,再通过电泳去除未被固定的脂质分子,从而最大程度上降低了似传统切片技术对组织的结构及重要组成成分的破坏,使其更接近于真实情况。

4.3 增加了组织的通透性,有利于大分子物质的通过[3,10]

CLARITY技术在增加组织透明度及重要分子稳定性的同时,在水凝胶网状结构上还形成了许多均匀的孔隙,这些孔隙为一些大分子物质(如抗体等)的出入提供了通道,从而为实现组织内重要物质的染色标记成为了可能。

4.4 保证了组织结构的稳定性,可经受多次漂洗和染色标记[10]

水凝胶组织稳定的结构,为其经受多次染色漂洗提供了保障。研究显示,多次的漂洗再染色不会明显导致重要生物分子的丢失,这将明显提高了同一批组织标本的有效利用,使得不同指标之间具有更强的可比性。

4.5 应用范围广[3,13]

自该技术成功应用于脑组织内突触及轴突等结构的研究以来,后续的证据表明,其几乎可适用于任何软组织的研究,如肝、脾、肾、肺、睾丸及肠组织等。因此,该技术不仅将在神经系统,更将在其他系统具有广阔的应用前景,如在全脑上进行长距离投射或局部环路研究;研究细胞之间的相互关系,亚细胞结构、蛋白复合体,核酸和神经递质等;在全脑上进行原位分子杂交,还可以进行反复的免疫组化染色和洗脱后的复染等等。

5 CLARITY技术的不足

尽管该技术在组织的结构-功能研究方面具有明显的优势和诱人的前景,但目前仍存在着一些不足。(1) 显微镜方面： 尽管目前已有CLARITY专用目镜的使用,但其进行图像采集的速度仍然较慢,不利于大数据的获取;(2) 软件方面： 当前仍旧缺乏成熟的局部图像分析、3D重建、自动跟踪技术及大数据储存和处理方法,限制了实验结构的定量分析;(3) 组织膨胀问题： 电泳过程中的组织膨胀可能会导致精细结构的破坏,尽管采用“4+1”的温控模式可能降低膨胀程度,但其可靠性有待继续论证;(4) 实验要求较高： 该技术对实验条件的要求较高,尤其是对用于图像采集所需显微镜的要求更高,因而限制了其在普通实验室的广泛推广和应用。以上存在的不足将为该技术的进一步完善提出了更大的挑战。