人类Argonaute基因家族与肿瘤关系的研究进展*

张成晨，刘莉娟，李 楠，郭秀丽，章梦琦综述，肖 娟，翟立红审校（湖北文理学院，湖北襄阳441053）

Argonaute（AGO）蛋白通过结合小RNAs来调控蛋白质的合成或影响mRNA的稳定性即RNA干扰（RNAi）。AGO蛋白家族是 RNA诱导沉默复合体（RISC）的核心蛋白，在RNAi中发挥重要作用，参与染色质修饰，靶向mRNA断裂、翻译抑制，从而产生特异性基因沉默作用[1]，并与多种恶性肿瘤的发生密切相关。AGO蛋白家族是一类高度保守的碱性蛋白，分为AGO亚家族（包括AGO 1～4）和PIWIL亚家族（包括PIWIL 1～4），其典型特征为N端的PAZ结构域、Mid结构域和C末端的PIWI结构域[2]。PAZ结构域和PIWI结构域形成一个供底物结合的沟槽，有助于sRNA和目标mRNA结合，并可以剪切mRNA[3]。PAZ结构域是核糖核蛋白复合体（RISC）中小RNAs的结合位点，PIWI结构域是RISC中的酶切割活性中心。

1 AGO1与肿瘤的关系

AGO1的PIWI结构域结合RNaseⅢ内切酶Dicer来调节Dicer酶和AGO蛋白之间的相互作用，从而促进RNAi的进行[4]。有研究提示，AGO1可能还通过参与异染色质沉默进而参与肿瘤的进展[5⁃6]。AGO1在细胞核中作用于DNA启动子区域，使组蛋白和靶基因发生甲基化，从而抑制基因表达[6⁃7]。AGO1在正常肺和肾的发育过程中和在缺少Wilms肿瘤抑制基因WT1的肾癌中高表达[8]，提示AGO1在这些组织的胚胎发生过程中起重要作用。BEHMT⁃ANSMANT 等[9]还发现，AGO1蛋白的PIWI结构域可与RNA沉默相关的GW182蛋白N端的GW重复结构相互作用，从而参与微小RNA（miR⁃NA）途径对目标mRNA的降解。姜琳等[10]对AGO蛋白亚家族研究发现，在人乳腺癌MCF7、子宫颈癌HeLa细胞系中，小干扰RNA（siRNAs）对AGO蛋白的基因沉默效果明显，AGO蛋白沉默导致细胞增殖活性下降，使肿瘤细胞周期阻滞在G0/G1期，其中AGO1沉默所致的细胞生长抑制程度最大。在结肠癌研究中，LI等[11]发现AGO1～4和PIWIL1～4表达于肿瘤组织明显高于癌旁组织；结肠癌组织与非癌组织相比，AGO1和PIWIL2表达显著可能代表新的早期诊断结肠癌标志物。

2 AGO2与肿瘤的关系

AGO蛋白家族在肿瘤的研究中，关于AGO2蛋白的报道较多。AGO2蛋白在生物体内广泛表达，具有核酸内切酶活性。AGO2的PIWI结构域与miRNA结合而参与mRNA的基因沉默[12]。AGO2表达水平与多种肿瘤的发生、发展，以及肿瘤细胞的增殖与分化、新生血管的发生、对缺氧应激的耐受性等密切相关。miRNA广泛参与肿瘤细胞增殖、浸润、转移等恶性生物学行为。

在癌前病变日光性角化病、皮肤基底细胞癌、鳞癌中，AGO2 均高表达[13]。在胃癌中，ZHANG 等[14]发现，随着病程的发展，AGO2的表达也在不断变化。在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌研究中发现，AGO2 mRNA的表达水平在癌症组织中较高，研究进一步发现AGO2可以通过增加黏附斑激酶基因的表达来参与肝细胞癌的进展[15⁃16]。在多发性骨髓瘤研究中，WU 等[17]发现，AGO2的高表达可使抗血管生成的miR⁃145和促血管生成的let⁃7家族及miR⁃17/92基因簇表达失调，进一步促进新生血管形成，进而参与肿瘤的迁移。VAKSMAN等[18]研究发现，在晚期卵巢浆液癌患者中，化疗后的AGO2 mRNA和蛋白水平较未化疗患者低，这可能是延长患者生存时间的一个潜在指标。在非小细胞肺癌研究中，DIEDERICHS等[19]发现，抑制AGO2的表达可使癌基因miR⁃100的表达下调，也使抑癌基因miR⁃34a、miR⁃125b的表达上调，提示AGO2在非小细胞肺癌中的高表达可能促进肿瘤的发展。最近研究发现，在宫颈癌中，通过miRNA和GRSF1参与miRNA途径AGO2的正向调节[20]。AGO2的表达增强通过 miR⁃346和GRSF1独立于AGO2稳定性的增加。miR⁃346通过上调AGO2的表达来增加宫颈癌细胞的恶性表型。miR⁃346对AGO2的上调也发生在其他类型的癌细胞中，包括SW480结直肠癌细胞和OVCAR3卵巢癌细胞。证明了miR⁃346在GRSF1依赖的方式上增加AGO2的表达，从而参与调节其他miRNAs的活性。这一发现暗示，miR⁃346可能是宫颈癌预防和治疗的潜在治疗靶点。CUBILLOS⁃RUIZ等[21]在对卵巢癌相关树突状细胞的研究中发现，在细胞内注入合成的内源性双链pre⁃miR⁃155表达出来的卵巢癌抑癌基因miR⁃155首先与AGO2结合，进入RNA诱导沉默复合体后，miR⁃155的活性明显增强，随后通过改变mRNA的表型来增强抗肿瘤免疫能力，提示AGO2可能与其他抑癌基因表达蛋白亲和力较高并可增强抑癌基因作用。SHEN等[22]研究发现，乳腺癌中的AGO2表达可与表皮生长因子受体（EGFR）互相作用。在缺氧状态下AGO2与EGFR的结合力加强，AGO2⁃Y393的磷酸化程度提高，进而降低了AGO2与Dicer的结合力，miRNA成熟受阻滞，进一步增加了肿瘤细胞的寿命及侵袭力。因此，AGO2的作用取决于其调节miRNA的功能来充当致癌基因或抑癌基因。

AGO2在不同肿瘤中的具体作用机制需要进一步研究，有望将AGO2作为肿瘤的早期诊断、发展过程及治疗预后的一个新的标志物，并为使用RNAi技术进行抗肿瘤治疗提供依据。

3 AGO3、4与肿瘤的关系

关于AGO3、4蛋白功能的报道相对较少。AGO3、1、4均位于1p34，串联在一个小的250 kb的区域，这一区域在原发神经外胚层瘤、Wilms瘤及许多其他恶性肿瘤中常发生缺失，提示上述3个基因的缺失可能促进肿瘤的发生。

最近研究了miRNA生物合成基因单核苷酸多态性（SNPs）与肺癌风险之间的关系，评估了在GEMIN4和AGO1中的5个SNP之间的关联，统计学上发现GEMIN4中的rs7813基因型和AGO1中的rs595961基因型仍与肺癌风险有关[23]。miRNA与一些重要的蛋白质，包括GEMIN4和AGO1，形成了miRISC，通过对目标mRNA的翻译和稳定性进行了负面的调控[24⁃26]。miRISC发挥作用类似于癌基因或抑癌基因通过抑制靶基因的表达参与多种肿瘤。miRNAs let⁃7的失调导致了细胞状态的分化和癌症的发展：通过靶向RAS和HM⁃GA2，let⁃7在人类细胞中作为肿瘤抑制因子发挥作用。WINTER等[27]发现，AGO3由其PAZ和MID域介导优先结合 let⁃7a⁃3，并特别规范了 let⁃7a⁃3p 活动，影响miRNA生命周期的晚期活动。在结肠癌中，LI等[11]发现AGO蛋白家族在癌症组织中均是高表达，在结肠癌的远处侵袭转移过程中AGO2～4和PIWIL4比其他AGO亚族蛋白表达量均高，提示高表达的AGO2～4和PI⁃WIL4可能有助于提高肿瘤侵袭能力。

姜琳等[10]在对人类乳腺癌MCF7、子宫颈癌HeLa、肺腺癌A549和胚肾细胞HEK293这4种细胞系中研究发现，AGO1～4在细胞系中均是稳定表达，提示AGO亚族蛋白在这4种细胞生长和增殖过程中扮演一个或不可缺的角色。

4 PIWIL1与肿瘤的关系

PIWIL1在人体中广泛表达，包括脑、心、肝、肾、骨骼肌、前列腺、卵巢。在人类干细胞的自我更新和RNA沉默起着至关重要的作用[28⁃29]，影响癌细胞的增殖。

在睾丸生殖细胞肿瘤研究中发现，PIWIL1在青年人和成年人中高表达[30]。田瑞卿等[31]发现，在卵巢细胞ES⁃2、肝癌细胞 QGY⁃7703、胃癌细胞 MGC803 和前列腺癌低转移细胞PC⁃3M⁃2B4中表达水平较高。对于前列腺高转移细胞系来说，PIWIL1表达水平低。在不同肝癌肿瘤细胞系中，PIWIL1的表达水平也不一致。不同肿瘤的PIWIL1的表达存在较大差异，同种肿瘤不同细胞株PIWIL1表达差异的机制尚需要进一步研究。在子宫内膜癌研究中，CHEN等[32]初步研究发现，PIWIL1在正常子宫内膜癌组织中沉默或表达弱，但在子宫内膜非典型增生和子宫内膜癌组织中强。特异性敲除子宫内膜癌细胞的PIWIL1，导致肿瘤的生长和转移发生潜在变化。PIWIL1可能是子宫内膜癌细胞的自我更新被激活所必需的分子道路的一部分。CD133和CD44是子宫内膜癌肿瘤干细胞的标志物。过表达PIWIL1，CD44表达增加；敲除PIWIL1，标志物CD44表达水平下降。在子宫内膜腺癌细胞中，通过抑制PIWIL1，肿瘤干细胞增殖、迁移能力、侵袭和成球的能力减弱。因此，PIWIL1可以调节子宫内膜癌细胞干性。PIWIL1还参与上皮间充质转化（EMT）过程，在子宫内膜癌诱导间充质细胞标志物Vimentin、N⁃adherin的表达，PIWIL1可多上调上皮标志物E⁃钙黏蛋白。进一步研究表明，PI⁃WIL1上调Snail的转录，表明PIWIL1可能是Snail诱导EMT所必需的[32]。敲除Snail可以逆转EMT并显著减弱癌细胞的迁移侵袭和肿瘤干细胞样特性。PIWIL1可以诱导EMT，赋予子宫内膜癌细胞干细胞样特性，但是Snail参与PIWI1调控的具体机制尚不清楚。在结肠癌中，PIWIL1的表达作用类似于子宫内膜癌，但PI⁃WIL1的确切机制尚不清楚。在体外研究胶质瘤、乳腺瘤和肉瘤显示，抑制PIWIL1通过不同机制抑制癌细胞生长[33⁃35]。

根据以往的研究，在提高肿瘤的增殖和侵袭等恶性行为中，PIWIL1 过表达起关键作用[36⁃38]，进而增加肿瘤发展的风险，是结肠癌、软组织肉瘤和胰腺导管腺癌预后不良的标志，可能是食管鳞状细胞癌和肝细胞癌预后的不良因素。在子宫内膜癌的研究发现，PIWIL1的表达与淋巴间隙受累、淋巴转移、肌层浸润之间呈显著正相关。因此，PIWIL1将可能作为抗癌治疗策略的一个新的、有前途的目标。

5 PIWIL2与肿瘤的关系

正常组织中，PIWIL2表达具有特异性，仅限在睾丸的生殖干细胞和精原细胞中表达。PIWIL2和参与的piRNA道路共同起转座子基因的表观修饰、稳定基因组特性的作用。在正常组织中缺乏PIWIL2蛋白的表达，而在肿瘤中异常高表达，则提示PIWIL2还参与了肿瘤的发生。PIWIL2可能也参与了DNA的修复[39⁃41]，从而发挥了其抑癌基因的作用。PIWIL2抑制细胞凋亡并通过激活 Stat3/bcli⁃xl通道（16）来促进增殖，PIWIL2/Stat3/c⁃src形成三聚蛋白复合物，进一步证实了这一发现。Stat3被c⁃src磷酸化，并转移到细胞核。随后Stat3与P53启动子结合并抑制其转录，从而抑制P53介导的细胞凋亡[42]。PIWIL2是作为癌基因或抑癌基因仍存在争议，在肿瘤中的主要机制还需进一步研究。

PIWIL2基因的表达在睾丸生殖细胞肿瘤、前列腺、乳腺、胃肠道、卵巢癌、子宫内膜癌、结肠癌鳞状细胞癌、宫颈腺癌和乳腺癌的各个阶段及白血病中得到验证[43]。在甲状腺乳头状癌（PTC）研究中，殷德涛等[44]发现，PIWIL2过表达，进一步研究发现PIWIL2 mRNA也升高，可能参与肿瘤的发生、发展。有研究发现，PIWIL2 mRNA的表达在所有检查的膀胱癌细胞系中都很低，甚至无法检测，在良性或恶性膀胱组织中PIWIL2的表达估计不到控制睾丸组织水平的0.5%[43]。在膀胱移行细胞癌研究中，曹正国等[45]发现PIWIL2高表达且体外转录合成的siRNA可抑制BIU⁃87细胞PIWIL2的表达，诱导肿瘤细胞凋亡。提示PIWIL2与膀胱癌的发生、发展密切相关，为治疗膀胱肿瘤提供依据。HE等[46]对宫颈癌的辅助肿瘤标志物的研究发现，PIWIL2在所有的癌前病变和恶性病变组织中都表达，在不同阶段和不同病变类型的宫颈癌中较p16INK4a有更广泛的表达，可以作为宫颈癌早期诊断的一个新的肿瘤标志物。在非小细胞肺癌（NSCLC）的PIWI同系物表达中，只有PIWIL2高表达。PIWIL2上调在NSCLC的进展中发挥了至关重要的作用。PIWIL2高表达促进细胞增殖和分化活动，抑制PIWIL2触发细胞凋亡和细胞周期G2/M期阻滞[47]。PIWIL2在预后差的NSCLC中表达过量。因此，PIWIL2的表达水平可以作为NSCLC预后的一个指标。在已有的乳腺癌研究中，LIU等[48]通过免疫组织化学比较PIWIL2与目前已知的乳腺癌肿瘤标志物雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、Her⁃2 和 Ki⁃67 表达水平，发现PIWIL2在各个阶段乳腺癌中均表达，而PI⁃WIL2在正常的组织中只有在睾丸中表达。提示PI⁃WIL2 较 ER、PR、Her⁃2 和 Ki⁃67 在诊断乳腺癌具有更高的灵敏度和特异性。

综上所述，PIWIL2在结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、甲状腺癌等肿瘤中都均高表达，并可作为上述恶性肿瘤的早期诊断、预后评估的一个新肿瘤标志物，以及为靶向治疗提供依据。

6 PIWIL3、PIWIL4与肿瘤的关系

关于PIWIL3和PIWIL4蛋白功能的报道很少。在果蝇的异染色质和染色质中，只有一种PIWI基因，在组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）上印上了甲基化标志，起着沉默目标基因和抑制RNA PolⅡ转录作用[49]。而在人类细胞中，PIWIL4 在肿瘤抑制基因位点 p16Ink⁃4a（CD⁃KN2A）上诱导 H3K9 甲基化（CDKN2A）[50]。最近研究发现，PIWIL4在乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞的细胞质和组织中高表达，PIWIL4表达的减少严重影响乳腺癌细胞迁移的能力，增加其凋亡，轻度影响其增殖[51]。通过蛋白质组和转录组的分析表明，在乳腺癌中的功能至少部分是通过其调节转化生长因子（TGF）和成纤维生长因子（FGF）信号通路与主要组织相容性复合体Ⅱ（MHCⅡ）类蛋白。提示PIWIL4可作为乳腺癌的一个潜在的治疗靶点。在人卵巢透明细胞癌ES⁃2细胞研究中，郭丽敏等[52]采用半定量RT⁃PCR检测发现，较癌旁组织中PIWIL4高表达。设计并化学合成针对PIWIL4的siRNA，用脂质体转染法将其转入ES⁃2细胞内，通过MTT和克隆形成实验发现，PIWIL4⁃siRNA可有效抑制ES⁃2细胞的生长活性和增殖能力，提示PIWIL4参与与卵巢癌发生、发展。

PIWI蛋白位于细胞核内，是转座子活性调节剂和表观遗传调节器；位于细胞质中，又是RNA翻译和稳定性的调节因子[53]。PIWI蛋白在干细胞的自我更新、转座子和RNA沉默、精子发生过程中、染色质重塑和转录调控在各种生物中起着重要的作用[54⁃55]。大多数研究表明，PIWI蛋白在人类癌症中过度表达，PIWIL1～4表达与T分期、高表达的淋巴结转移、临床TNM分期和患者生存时间较短呈正相关[11，56]。在异常DNA甲基化的转座原件发现TES区域，TES区域不稳定可能导致基因组不稳定并影响癌基因和抑癌基因的表达，而PI⁃WI蛋白在控制TES稳定性中扮演重要角色[57⁃58]。通过与piRNA相互作用，PIWI维持基因组的稳定性[59]。但在肿瘤中的具体作用如异染色质化、DNA修复等还需要进一步研究。随着研究的深入，PIWI蛋白在肿瘤的早期诊断、治疗和预后评估有望成为一种新的标记物和治疗靶点。

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