幽门螺杆菌致病因子作用机制研究概述

毕 月，罗 微，谷海瀛*

(1.宁波大学 医学院，浙江 宁波 315000；2.天津医科大学总医院 检验科，天津 300352)

1994年幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)被世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)列入一类致癌因子。Hp的发病机制和疾病的转归是一个复杂的过程，主要是通过细菌毒力因子、宿主和环境因素之间复杂的相互作用来调节。既往认为与胃癌进程密切相关的毒力因子有：CagA(细胞毒素相关蛋白A)、VacA(空泡毒素A)、Urease(脲酶)和DupA(十二指肠溃疡启动蛋白A)。近年来，新的研究和观点认为除上述毒力因子外，鞭毛、黏附素相关蛋白及溶血素等在致病过程中也扮演着重要角色[1- 2]。Hp致病过程主要通过4个阶段来完成：1)进入宿主及环境改造阶段；2)动力趋避阶段；3)黏附定植阶段；4)毒力因子释放及损伤阶段。本文就各阶段中致病因子的新研究进展作一综述。

1 Hp进入宿主及对生存环境的改造阶段

Hp主要依靠“人-人”和“粪-口”途径、较少情况下也可通过胃镜等器械进行医源性传播，是极少数能够在胃内酸性环境下生存的细菌。这一阶段发挥主要作用的是Hp的脲酶，该酶以胞质和表面蛋白两种形式存在，由脲酶亚基A、B及其他7个脲酶活性蛋白因子组成。脲酶可以水解尿素生成氨和二氧化碳调节胃内pH值缓解酸性环境和炎性反应引起的杀菌作用。同时，脲酶产生的氨可诱导细胞凋亡，促使组织损伤及溃疡的形成。有研究认为脲酶在定植、激活单核细胞的趋化活性、抑制吞噬细胞的吞噬作用、对炎性细胞因子和iNOS的诱导过程中都发挥重要作用，但是其活性与临床结果及组织的病理变化的关系并不十分清楚，仅有研究表明在溃疡组织处收集的标本中，其活性会更高[3]。该酶发挥作用时需要金属辅助因子镍与金属伴侣(HypA)的参与[4]。脲酶阴性的Hp突变体不能在上皮细胞中持续感染，无镍饮食加标准的Hp三联疗法被证实能提升Hp的清除率[5]。这一发现可能为Hp的常规抗生素治疗耐药性问题的解决带来更多转机。

2 Hp鞭毛动力趋避阶段

有报道鞭毛动力是Hp定植的关键因素[6]。Hp鞭毛主要由基体、鞭毛钩及丝组成。较早进入研究视野的是鞭毛丝蛋白FlaA、FlaB、鞭毛钩蛋白FlgE，这些研究对鞭毛的致病性有了进一步的补充。近年来，鞭毛丝聚合蛋白FliD的抗原性及免疫原性也得到了重视，FliD蛋白及其抗体水平与胃癌的风险呈正相关[7]，可作为胃癌风险评估的潜在靶标。另有研究指出，Hp鞭毛蛋白免疫小鼠所产生的免疫原性几乎等同于Hp全菌裂解液[8]，更暗示了Hp鞭毛具有强抗原性及免疫原性。目前，Hp鞭毛的研究已较为深入，已探讨到鞭毛基因的表达调控。已有多达40多种蛋白被证实参与了鞭毛组装合成的调控[9]，其中管家基因80(rpoD)、控制调节基因(rpoN、flgR、flgS及flhA)与结构基因(motA与motB)，主要调控基体中与趋化性有关的蛋白表达; 54(rpoN)控制着鞭毛基因flgB、flgE、flgK、flgM、flgL与28(fliA)，主要是鞭毛杆和钩部分蛋白的表达;28(fliA)同时也调控着flaA，主要是鞭毛丝成分的蛋白表达[10]。这些鞭毛基因的调控表达的研究对于揭示Hp致病性提供了更多的参考依据。值得注意的是，Hp鞭毛与其他细菌(如铜绿假单胞菌)的鞭毛在致病机制方面是否有存在相通点却少见报道，若能参考其他鞭毛菌的机制研究或将为Hp致病机制的揭示提供更多的思路。

3 黏附及定植阶段

胃内定植是Hp致病的前提，而黏附又是定植的关键。Hp在宿主内存活数十年之久的原因之一，就是通过许多受体特异性黏附素直接与黏蛋白、宿主细胞及细胞外基质结合。Hp与胃上皮细胞间黏附力极强，可致被吸附的细胞表面变性、微绒毛消失、细胞骨架改变，这种黏附作用具有组织、宿主及部位的特异性。当Hp定植在胃黏膜上时，细菌黏附素与细胞受体的相互作用可以保护细菌，避免细菌被胃蠕动和胃排空的力量排出胃内，随后细菌获得代谢底物和营养物质，并通过释放毒素来破坏宿主细胞，改善生存环境。Hp可与黏蛋白、胃黏膜上皮细胞、基质蛋白结合，其过程中发挥重要作用的是黏附素。目前已发现20多种黏附素，比较有名的是血型抗原结合黏附素BabA与BabB、唾液酸结合黏附素HpaA与SabA/B、黏附素相关蛋白AlpA与AlpB、中性粒细胞激活蛋白(NAP)、热休克蛋白60(Hsp60)和外膜蛋白HopZ等[2]。其中，最重要的是Bab黏附素，目前已经发现了3种Bab的等位基因，babA1、babA2和babB，但是只有babA2基因产物可以与Leb抗原(Lewis血型抗原，O型血患者胃黏膜高表达Leb抗原)结合[11]。BabA被认为是最好表达的黏附素，可与胃上皮细胞表达的ABO组织抗原和相应的Leb抗原结合。BabA2阳性基因型与消化性溃疡之间存在一定联系[12]，但该说法尚存在争议。为可动态地观察在患者感染期间Leb抗原的黏附性，从长期感染的患者中连续获取的Hp的分离株的序列发现80%的菌株中babA2与Leb抗原结合。由此可见，这种结合在Hp的慢性感染期间是较稳定的[13]。

4 毒力释放及宿主损伤阶段

Hp在胃黏膜细胞定植后会释放相关毒素，较为经典的毒力因子有CagA、VacA和dupA等。研究较多的毒力因子是CagA，由Hp致病岛编码，通过IV型分泌系统进入宿主细胞。Hp致病岛是一个典型的染色体DNA插入原件，也是IV型分泌系统的编码基因，CagA还可以在几个方面影响宿主细胞，如胃上皮细胞基底的形成、细胞骨架的变化、细胞的增殖、以及刺激胃上皮细胞分泌IL- 8[14]。CagA还可作为启动子，通过对生物信号蛋白直接或间接影响多个宿主细胞信号通路，导致癌基因上调；同时促进细胞增殖、转移分化、减少细胞凋亡，利于肿瘤发生[15]。另一个较为重要的毒素是VacA，不同于CagA，CagA并不是所有菌株中都含有，而VacA几乎在所有的Hp菌株中都存在[16]。VacA是一种穿孔毒素，编码产生140 ku的前体毒素，通过自身加工后形成成熟88 ku的分泌毒素p88。p88又进一步切割形成分子大小为33和55 ku的片段，即p33和p55，其中A亚基(由p33组成)负责孔形成，B亚基(由p55组成)负责与宿主细胞膜相互作用[17]。VacA是分泌蛋白，能与肥大细胞结合诱导炎性因子释放，加重组织损伤；还可在上皮细胞膜形成选择性离子通道促进HCO3-外流，降低胃酸分泌；此外，VacA还具备免疫调节功能，分泌进入宿主后会阻滞B细胞递呈，编码分泌毒素，诱导体外细胞程序化死亡，抑制T细胞增殖，这些也是Hp逃避天然免疫的机制[18]。

毒力因子基因dupA在Hp基因组等位基因中具有较高多样性且与virB同源。有观点认为dupA是十二指肠溃疡进展的风险标志物和胃癌的抑制因子[19]。目前，相关研究发现dupA中GC碱基含量低于Hp基因组其余部分，并在该区域观察到很高的变异性，所以称为“可塑性区域”。但值得注意的是，dupA与消化道疾病的相关性在不同报道中仍存在差异，这可能是地区及人群的差异性所致。许多革兰阴性菌和革兰阳性菌的溶血素是微生物感染和发病机制的关键因素。溶血素常由细菌分泌，作为水溶性单体蛋白扩散到靶细胞膜，与特异性受体结合。Hp溶血现象是通过破坏吞噬细胞内的液泡膜以及上皮细胞引起的细胞裂解形成的。Hp在SRBC琼脂平板上产生溶血环，被分类为β-溶血性，且溶血活性会在缺铁的条件下增加[20]。Hp基因组序列的研究表明，至少存在两种不同的溶血素，HP1086和HP1490。当与葡聚糖5000重合时，Hp的体外溶血活性降低，表明存在成孔毒素(pore-forming)。HP1086与来自其他细菌种类的成孔溶血素(TlyA)具有同源性。将克隆的TlyA同系物导入大肠杆菌非溶血性菌株，观察到了溶血活性。而TlyA突变体则显示出了体外溶血性的降低，并且不受葡聚糖5000的影响。其突变体还显示出对人胃腺癌细胞的黏附性降低，也不能定居在小鼠的胃黏膜上[20]。TlyA在37 ℃下会产生淀粉样变性，产生的TlyA聚合物中存在典型的淀粉状样原纤维，且这种淀粉样变性产生的聚合物与蛋白质的二级和三级结构组织的改变相关。更重要的是，TlyA的预先形成的淀粉状样聚合物对抗胃腺癌细胞表现出强烈的细胞毒活性[21]。而从大肠杆菌中重组纯化过的TlyA对人红细胞表现出突出的溶血活性，推断其是通过在细胞膜中形成了特定直径的孔。此外，还发现Hp的TlyA显示出可以破坏和融合脂质体膜，使脂质体囊泡聚集的能力，并且不需要任何受体[22]，这些研究都充分说明了TlyA的毒力作用。另外重要的毒力因子是外膜蛋白A(OpiA)，其被证明与Hp感染后临床症状、细菌定植密度、中性粒细胞浸润程度及炎性因子IL- 8释放水平密切相关[23]。有报道称在胃十二指肠疾病患者中，OpiA检测的阳性率高达71.5%，可作为评价相关疾病严重程度的潜在靶标[24]。

5 结论

通过对Hp致病因子的研究，Hp发病机制和疾病发展的过程越发清晰。除经典的致病因子进展外，新的观点及毒力因子也被提出或发现，如黏附素蛋白、DupA和OpiA的发现等。值得注意的是文中所述的各阶段并不具备严格时间界限，相关致病因子可在不同阶段都发挥作用。如脲酶不仅在进入机体的初步阶段参与了对其定植环境(pH值)的改造，也会对胃黏膜上皮细胞造成炎性反应损伤；OpiA不仅是在毒力损伤阶段发挥作用，对于Hp的定植也存在影响[24]。Hp鞭毛不仅在定植中发挥重要作用，其对巨噬细胞的自噬功能可能也存在抑制作用[25]，相关实验正在进行，以期进一步验证。总体来看，Hp致病因子与免疫细胞相互作用方面的研究相对较少，大多数研究往往停留在与疾病相关的临床研究或简单的基础研究层面上，其详细的致病机制、信号通路信息等都有待进一步挖掘。相信随着研究的深入，会为研究者们提供更多Hp致病机制的信息，对于Hp感染的诊断、治疗及疫苗的研究都有重大的意义。

参考文献：

[1] Gu, H. Role of flagella in the pathogenesis of Helico-bacter pylori[J]. Curr Microbiol, 2017, 74:863- 869.

[2] Kao CY, Sheu BS, Wu JJ. Helicobacter pylori infection: An overview of bacterial virulence factors and pathogenesis[J]. Biomed J, 2016, 39:14- 23.

[3] Ghalehnoei H, Ahmadzadeh A, Farzi N,etal. Relationship between ureB sequence diversity, urease activity and genotypic variations of different Helicobacter pylori strains in patients with gastric disorders[J]. Pol J Microbiol, 2016, 65:153- 159.

[4] Hu HQ, Johnson RC, Merrell DS,etal. Nickle ligation of N-terminal amine of HypA is requried for urease maturation in Helicobacter pylori[J]. Biochemistry, 2017, 56:1105- 1116.

[5] Campanale M, Nucera E, Ojetti V,etal. Nicle free-diet enhances the Helicobacter pylori eradication rate:a pilot study[J]. Dig Dis Sci, 2014, 59:1851- 1855.

[6] Kao CY, Sheu BS, Wu JJ. CsrA regulates Helicobacter pylori J99 motility and adhesion by controlling flagella formation[J]. Helicobacter, 2014, 19:443- 454.

[7] Li H, Zhang B, Hu X,etal. Serum Helicobacter pylori FliD antibody and the risk of gastric cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7:22397- 22408.

[8] Skene C, Young A, Every A,etal. Helicobacter pylori flagella:antigenic profile and protective immunity[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2007, 50:249- 256.

[9] Lertsethtakarn P, Ottemann KM, Hendrixson DR. Motility and chemotaxis in Campylobacter and Helicobacter[J]. Annu Rev Microbiol, 2011, 65:389- 410.

[10] Tsang J, Hoover TR. Bassal body structures differentially affect transcription of RpoN- and FliA-Dependent flagellar genes in Helicobacter pylori[J]. J Bacteriol, 2015, 197:1921- 1930.

[11] Talebi BAA, Taghvaei T, Mohabbati Mobarez A,etal. High correlation of babA 2-positive strains of Helicobacter pylori with the presence of gastric cancer[J]. Intern Emerg Med, 2013, 8:497- 501.

[12] Chen MY, He CY, Meng X,etal. Association of Helicobacter pylori babA2 with peptic ulcer disease and gastric cancer[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19:4242- 4251.

[13] Nell S, Kennemann L, Schwarz S,etal. Dynamics of Lewis b binding and sequence variation of the babA adhesin gene during chronic Helicobacter pylori infection in humans[J]. Mbio, 2014, 5:223- 236.

[14] Wang F, Qu N, Peng J,etal. CagA promotes proliferation and inhibits apoptosis of GES- 1 cells by upregulation TRAF1/4- 1BB[J]. Mol Med Rep, 2017, 16:1262- 1268.

[15] Yong X, Tang B, Li BS,etal. Helicobacter pylori virulence factor CagA promotes tumorigenesis of gastric cancer via multiple signaling pathways[J]. Cell Commun Signal, 2015, 13:30.

[16] Rassow J, Meinecke M. Helicobacter pylori VacA:a new perspective on an invasive chloride channel[J]. Microbes Infect, 2012, 14:1026- 1033.

[17] Bridg DR, Merrell DS. Polymorphism in the Helicobacter pylori CagA and VacA toxins and disease[J]. Gut Microbes, 2013, 4:101- 117.

[18] Yuan J, Li P, Tao J,etal. H.pylori escape host immunoreaction through inhibiting ILK expression by VacA[J]. Cell Mol Immunol, 2009, 6:191- 197.

[19] Yamaoka Y, Graham DY. Helicobacter pylori virulence and cancer pathogenesis[J]. Future Oncol, 2014, 10:1487- 1500.

[20] Martino MC, Stabler RA, Zhang ZW,etal. Helicobacter pylori pore-forming cytolysin orthologue TlyA possessesinvitrohemolytic activity and has a role in colonization of the gastric mucosa[J]. Infect Immun, 2001, 69:1697- 703.

[21] Lata K, Chattopadhyay K. Helicobacter pylori TlyA forms amyloid-like aggregates with potent cytotoxic activity[J]. Biochemistry, 2015, 54:3649- 3659.

[22] Lata K, Paul K, Chattopadhyay K. Helicobacter pylori TlyA agglutinates liposomes and induces fusion and permeabilization of the liposome membranes[J]. Biochemistry, 2014, 53:3553- 3563.

[23] Zhang J, Qian J, Zhang X,etal. Outer membrane inflammatory protein A, a new virulence factor involved in the pathogenesis of Helicobacter pylori[J]. Mol Biol Reports, 2014,41:7807- 7814.

[24] Souod N, Sarshar M, Dabiri H,etal. The study of the oip A and dupA genes in Helicobactor pylori strains and their relationship with different gastroduodenal diseases[J]. Gastroenterol Hepatol Bed Bench, 2015, Suppl 1:S47- 53.

[25] 张晋玲，罗微，谷海瀛. 幽门螺杆菌鞭毛的分离鉴定及对巨噬细胞自噬功能影响的初步研究[J]. 免疫学杂志, 2016, 32:917- 920.