生脉散对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞NF-κB/IκB及VEGF表达的影响

吴小慧，刘菲，段忠心

(南华大学附属第二医院，湖南衡阳421001)

2型糖尿病(T2DM)发生、发展的始动因素是胰岛素抵抗[1]，而胰岛素抵抗还是一个慢性亚临床炎症反应过程[2]。NF-κB/IκB信号通路是炎症导致胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能减退以及动脉粥样硬化的重要途径之一[3]。中医认为，糖尿病的发病机制主要为阴津亏损、燥热偏盛。生脉散是益气养阴的基础方，临床常用于治疗糖尿病，但目前对其作用机制尚不清楚。2015年3～12月,本研究观察了生脉散对T2DM大鼠胰岛素抵抗、胰岛β细胞NF-κB/IκB表达及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响，旨在探讨生脉散治疗T2DM的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠120只，清洁级，8周龄，体质量180～225 g，购自南华大学实验动物学部，动物许可证号：SYXK(湘)2015-0001。本研究经南华大学动物伦理委员会批准。

1.2 主要药物、试剂及仪器 生脉散组方：人参9 g、麦门冬9 g、五味子6 g，购自湖南三湘中药饮片有限公司，经加工研制成汤剂，由南华大学附属第二医院中药房提供；SYBRGreen qPCR试剂盒(上海达为科生物科技有限公司)，链脲佐菌素(美国Sigma公司)，阿司匹林肠溶片(湖南新汇制药股份有限公司)；PCR仪器(美国ABI公司)，离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，血糖仪(长沙三诺生物传感股份有限公司)。

1.3 动物分组、模型制备及药物干预 将120只SD大鼠随机分为A组20只和造模组100只。A组予以基础饲料喂养。造模组基础饲料适应性喂养1周，给予高脂饲料(碳水化合物热卡占20%，脂肪热卡占61%，蛋白质热卡占19%，脂肪成分主要为熟猪油)喂养8周，一次性腹腔注射0.25%链脲佐菌素30 mg/kg(用pH 4.4的0.1 mol/L无菌枸橼酸缓冲液配制)。注射72 h测血糖>16.7 mmol/L，表明造模成功。造模组建模成功70只，随机分为B、C、D、E、F组，每组14只。B组给予等量生理盐水灌胃，C组给予0.2 g/(kg·d)阿司匹林灌胃，D、E、F组给予4.7、9.4、18.8 g/(kg·d)生脉散汤剂灌胃，持续治疗4周。实验期间，A、B、C、D、E、F组分别死亡6、3、1、2、1、3只。

1.4 空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)检测及胰岛素敏感性指数(ISI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)计算 治疗前及治疗4周，大鼠进食12 h，尾静脉取血约5 mL，离心留取血清，-20 ℃冰箱保存。分别采用血糖仪和ELISA法检测FPG、FINS，计算ISI、HOMA-IR。ISI=1/FBG×FINS，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.5 血清VEGF检测 大鼠麻醉后球后取血5 mL，按ELISA试剂盒说明书进行加样，封膜板盖住反应板，恒温箱温育约60 min，洗涤后加入显色剂，恒温避光显色12 min，加入终止液，10 min后采用酶标仪依序测量各孔的吸光度。根据标准品曲线，计算血清VEGF水平。

1.6 主动脉血管结构观察 大鼠麻醉后，迅速取出主动脉组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续冠状切片。切片分别予二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、苏木素-伊红染色、乙醇复脱、二甲苯透明，树胶封片，显微镜下观察。

1.7 胰腺组织NF-κB、IκB mRNA检测 大鼠麻醉后，迅速取出胰腺组织，- 80 ℃保存，按照试剂盒和逆转转录试剂盒说明书进行RNA提取和cDNA制备，然后进行PCR扩增。NF-κB上游引物：5′-AGTTGGAGCAGCTGCAGCGC-3′，下游引物：5′-GGAGGGCTCCGCTGGTT-3′；IκB上游引物：5′-GCAACCCAGTGGTGGCCCAG-3′，下游引物：5′-CTCCCGCTGGCTGACCTGGA-3′；β-action上游引物：5′-AGAACATCATCCCTGCATCC-3′，下游引物：5′-TGGATACATTGGGGGTAGGA-3′。经吸光度扫描仪扫描，PCR条带用软件进行定量分析，基因表达量用β-action内参进行标准化。

2 结果

2.1 各组治疗前后FPG、FINS比较 见表1。

表1 各组治疗前后FPG、FINS比较

注：与同组治疗前比较，aP<0.05；与B组治疗同期比较，bP<0.05；与C组治疗同期比较，cP<0.05。

2.2 各组治疗前后ISI、HOMA-IR比较 见表2。

2.3 各组治疗前后血清VEGF水平比较 A、B、C、

表2 各组治疗前后ISI、HOMA-IR比较

注：与同组治疗前比较，aP<0.05；与B组治疗同期比较，bP<0.05；与C组治疗同期比较，cP<0.05。

D、E、F组血清VEGF水平分别为(211.430±11.359)、(273.910±4.527)、(258.690±4.423)、(262.170±5.149)、(247.080±4.907)、(245.450±3.532)pg/mL。与A组比较，B、C、D、E、F组血清VEGF水平均明显升高(P均<0.05)；与B组比较，C、D、F组血清VEGF水平均明显降低(P均<0.05)；与C组比较，E、F组血清VEGF水平均明显降低(P均<0.05)。

2.4 各组主动脉血管结构比较 A组血管内侧壁平整光滑，平滑肌细胞排列整齐；与A组比较，B组血管内侧壁内膜粗糙，平滑肌细胞排列紊乱；与B组比较，C、D、E、F组血管内侧壁内膜稍粗糙，平滑肌细胞排列不规则，E、F组血管壁结构损伤较C、D组有所缓解。

2.5 各组胰岛β细胞NF-κB、IκB mRNA表达比较 见表3。

表3 各组胰岛β细胞NF-κB、IκB mRNA相对表达量比较

注：与B组比较，aP<0.05；与C组比较，bP<0.05。

3 讨论

目前，国内糖尿病患者数量超过1亿，其中T2DM约占90%[4]。在T2DM患者中，胰岛素抵抗的发生率超过80%[5]，胰岛素抵抗与NF-κB信号转导通路关系密切。糖尿病状态下，高血糖、高血脂及胰岛素抵抗等病理机制诱发的炎症反应，是导致糖尿病冠状动脉粥样硬化性心脏病发生、发展的重要原因[6]，通过降低炎症反应、改善胰岛素抵抗、控制血糖水平是防治糖尿病性冠心病的重要途径。

糖尿病在中医学中属于“消渴”范畴，主要病机为阴虚为本、燥热为标。生脉散出自《医学启源》一书，方中人参甘温，有益元气，具有生津液、补肺气的作用，用以为君；麦门冬甘寒，具有润肺生津、养阴清热的作用，是为臣药；人参与麦门冬合用，更彰显益气养阴之效；五味子酸温，有敛肺止汗、生津止渴之功，为佐药；三药合用，一补一润一敛， 益气养阴，气充脉复，为益气养阴的基础方，临床上常用于治疗糖尿病[7,8]。但目前对其作用机制尚不清楚。

NF-κB是一个具有多向转录激活功能的调节因子，是炎症介导胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能减退的重要途径，属于炎症反应过程的关键调控因子，主要通过氧化应激引起炎症反应，继而导致糖尿病及其并发症的发生[3]。IκB位于细胞质内，主要在非激活状态下通过拦截NF-κB的核定位序列阻止NF-κB的核定位，抑制其激活，IκB受IκK的调节，使其丝氨酸残基磷酸化[9]，诱导IκB快速分解，充分暴露NF-κB的核定位序列，激活后迅速移位，与κB的位点结合，调节靶基因转录，参与炎症反应和细胞分化，引起胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能减退。同时，NF-κB还能诱导外周血单个核细胞，使单核细胞向动脉内膜迁移形成泡沫细胞，加速动脉粥样硬化，引起糖尿病相关并发症[10]。VEGF能够增加血管通透性，对单核细胞和巨细胞有化学趋化作用，是糖尿病血管病变的高危因子[11,12]，可引起血管壁结构改变，加速动脉粥样硬化形成。

本研究结果显示，E、F组能显著降低FBS、FINS和HOMA-IR，升高ISI，降低血清VEGF水平，改善血管壁结构，降低NF-κB mRNA，提高IκB mRNA表达，效果优于C组；而D组上述效果与C组比较无明显统计学差异，说明精确的剂量控制才能使生脉散发挥最佳的治疗效果。

总之，生脉散能够明显改善T2DM大鼠胰岛素抵抗，降低血清VEGF水平，改善血管壁结构，其作用机制可能是通过抑制NF-κB/IκB表达实现的。