牛羊检疫的技术要点探讨

杨伟翔，李 娟

（广东省深圳市宝安区动物卫生监督所，广东深圳518101）

牛羊临床常发的疾病有消化道疾病、呼吸道疾病以及全身感染性菌血症等，其中细菌性感染所占比例能占到临床病例的70%以上，对养殖危害巨大，故快速准确地对细菌性感染进行检疫对临床意义重大，下面笔者以此为话题和大家作一下探讨。

1 牛羊消化道特点

牛羊为反刍动物，其消化道有别与单胃动物，牧草经口腔首先进入瘤胃进行消化，而瘤胃中的消化过程非常复杂，因牧草植物纤维含量较高，纤维本身属于多糖的一种，其本质也是由单糖分子构成。无论是单胃动物还是反刍动物，其消化道中的消化液都不含纤维素酶成分，不会对纤维素产生分解作用。对于单胃动物来讲，植物类纤维主要起到清扫肠道的作用，对于反刍动物而言，虽然它们同样不能直接分解纤维素，但由于瘤胃中含有大量的益生微生物，如细菌、真菌、纤毛虫等，这些微生物对纤维类物质能起到分解作用，最终形成有机酸被机体吸收，故瘤胃环境是偏酸性的，酸性环境不利于其他有害菌的生长，利于维持整个微生态的平衡。

2 致病菌的鉴定

由于消化道中有大量益生微生物干扰，故需要加以区分鉴别。常用的判断方法有溶血法，如果分离到的细菌有溶血作用，则代表对动物有一定毒性，还有动物模型法，常用的动物为小白鼠，将分离的可疑菌通过液体培养基增殖后，通过腹腔注射入小鼠体内，如果和空白组相比，试验组小鼠明显出现食欲下降、精神不振、全身组织器官炎症坏死甚至死亡等情况，则代表分离的菌株是致病菌。但实际存在的问题是，已经可以证明有少部分的菌株即使是非致病性也有一定的溶血作用，同时有些正常菌株在注射入腹腔后，也会引发腹膜炎，使得实验小鼠表现一系列临床症状，导致判断结果的不确定性增加。

3 检疫技术

为了克服上述缺陷，目前有两种比较成熟的方法用以解决标准判定问题，分别为菌群对比法和分子生物学法。

3.1 菌群对比法

菌群对比法依赖大数据，简而言之就是将健康状态下的牛羊，通过测定不同生长阶段的瘤胃微生物菌群结构种类，汇总一个整体数据，这个数据即是一个健康动物的参考标准，如果发生细菌性消化道疾病，则瘤胃中的微生态菌群结构必然出现大的改变，通过对比正常菌群的结构就能快速判断出疾病类型和感染菌株的种类，哪种数量明显增加的菌种即为感染的致病菌，将其分离保存备用。

保存的致病菌菌株有何作用呢，一般会用在两个方面，一是药敏数据的测定，常用的方法是纸片法和试管法，药敏试验可以测定出分离的致病菌株对应的敏感药物种类，继而选用敏感抗生素进行治疗。还能通过横向和纵向对比药敏数据，判断养殖场的菌株耐药变化情况，便于及时调整用药方案，减少耐药情况的发生。二是致病菌株可以人为扩大培养，并通过物理或化学方法灭活后，制备成自家苗免疫健康羊只，便于及时控制疫情，如羊大肠杆菌性腹泻疫苗就是将致病性大肠杆菌分离纯化，通过普通肉汤培养基进行培养扩增，加入甲醛溶液灭活后，再加入铝胶佐剂，每只羊视个体大小肌肉注射0.5～2.0ml，一周之内便可产生高滴度的大肠杆菌抗体，保护健康羊只不受感染。

3.2 分子生物学法

通过测定基因的序列和基因库中的致病微生物的序列进行对比，如果重合度相同，则代表所分离的菌株为致病性微生物，反之则是非致病性的。分子生物学法结果比较直观和准确，但需要人类建立庞大的基因数据库，目前这个基因库还不是十分的完善，且其中可能有一定概率的错误，后期需要大量实验去补充和修改。目前这个基因库中的数据以国外研究较多，由于我国的养殖模式、气候环境、牛羊品种、饲草种类等和国外有一定差异，结果只能作为参考，同时希望我国政府能够重视这项工作，使我国的检疫水平能够上一个新台阶。

4 呼吸道和全身感染

呼吸道和全身菌血症性感染与消化道感染性疾病不同，前两者不存在自身微生态系统，其本身环境纯净，呼吸道中可能存在极少量的条件致病菌，而机体内环境中更是不会存在微生物。当发生感染后，只要无菌操作规范，基本分离到的菌都是确定的致病菌株，不存在像消化道那样有益生微生物的干扰情况，因此，呼吸道和全身感染性病原确诊相对简单，病原分离后可通过形态观察、生物学特性鉴定、血清学鉴定、分子生物学方法等对结果进行判断。

5 临床常见致病菌的检疫

5.1 沙门氏菌病的检疫

牛羊沙门氏菌感染类型多为鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌和流产沙门氏菌，主要发生于肠道，生殖道中也能分离到。沙门氏菌的菌体形态、菌落外观以及染色特征等与大肠杆菌很像，需要经过生化鉴定才能将二者区分。最常采用的方法是鉴别培养基法，由于大肠杆菌能发酵乳糖，而沙门氏菌不发酵，故在麦康凯培养基上大肠杆菌显粉红色菌落，沙门氏菌为无色菌落，在伊红美蓝琼脂上培养时，表面带有金属光泽的菌落是大肠杆菌，若为中间黑色，四周环状透明的菌落，则为沙门氏菌。另外，沙门氏菌代谢过程中能产生硫化氢，遇到亚铁离子便生成黑色沉淀，可以通过三糖铁培养基将二者鉴别。利用生化反应的特征不同进行病原鉴别可使疫情得到快速判断。

5.2 布氏杆菌病的检疫

布氏杆菌病主要表现慢性或隐性感染，其检疫一般通过血清学检查和变态反应检查。血清学检查有两种，一种是通过已知抗体检查病料中是否有布氏杆菌抗原，常用方法有荧光抗体技术、反向间接凝集试验、间接炭凝集试验和免疫组化法等；另一种是通过已知抗原检测感染后7～15d之内的可疑病畜体内是否存在高滴度的抗体，通过抗原抗体凝集试验、ELISA等方法进行检查。变态反应检查适用于大群动物的检疫，检测时将布氏杆菌水解素以0.2～0.3ml的量注射到牛羊的尾根皱褶部位或肘关节后侧无毛部分的皮内，注射后观察24～48h，如果发生红肿，则变态反应呈阳性，可以断定羊只感染。变态反应法检出率高，结果准确，水解素注射后不会产生抗体，对后期血清学检查无影响，临床应用较为广泛。

5.3 魏氏梭菌的检疫

魏氏梭菌是消化道常见感染菌，由于本菌厌氧且对糖类分解作用强，绝大多数的糖类如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、淀粉、糊精等都可分解，分解后产酸产气剧烈，利用这一特征，可设计牛乳暴烈发酵试验来判定。将牛乳培养基置于无菌试管中，接种可疑菌落后液面用灭菌石蜡液封，37℃恒温培养约6～8h，可见培养基中产生大量气泡，由于发酵过程产酸，能将乳中酪蛋白凝固，使得外观看起来如海绵状，产生的气泡可将凝固的酪蛋白冲散，外观可见动态的发酵过程，故称暴烈发酵试验，这个试验可用于快速检测魏氏梭菌感染。

6 讨论

除了沙门氏菌、布氏杆菌、魏氏梭菌外，还有巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌等重要细菌类型在临床同样比较常见，鉴定方法大同小异，主要为病原分离、染色观察、生化鉴定、血清学鉴定、分子生物学鉴定等。和病毒感染不同，细菌感染目前都有针对性的敏感抗生素进行治疗，只要治疗时机恰当，用药科学，大部分的细菌感染都预后良好。由于我国畜牧业发展水平和国外发达国家相比还有一定差距，临床用药监管不严格，临床上滥用抗生素的情况还存在，最终导致耐药菌株产生的速度加快，同时药物在机体中的代谢时间延长，肉、奶等食品中的药物残留也加大，严重危害食品安全，我国政府一定要予以重视。