补体对细胞凋亡作用研究进展

黄旭东,吴广礼

补体作为机体重要的防御体系，与细胞凋亡一起维持着内环境的稳定，而补体的部分作用是通过影响细胞凋亡而实现的。补体系统活化后生成的很多补体蛋白与细胞凋亡有着相互促进作用。由于补体家族及细胞凋亡相关蛋白成分众多，作用机制复杂，对其作用尚缺乏认识。现将补体对细胞凋亡的作用研究进展综述如下。

1 补体

补体广泛存在于人体血液、组织液及细胞膜表面，是机体精密调控的防御体系。既往有研究报道，补体系统由30多种蛋白组成，随着研究的深入，不断有新成员加入，新近报道补体蛋白达50多种，包括可溶性蛋白和膜结合蛋白[1-2]。补体主要生理功能为免疫防御功能，其在体内具有强化吞噬、增强吞噬细胞的趋化性、免疫复合物的溶解、中和病毒、免疫反应的调节等作用，是机体免疫防御机制重要部分，对消除外来因素，特别是抗原侵害，维护机体内环境平衡具有重要作用[3]。补体系统由补体固有蛋白、补体调节蛋白、补体受体组成[4]。固有成分包括：C1～C9、甘露糖结合凝集素、相关丝氨酸蛋白酶、B因子、D因子等。调节蛋白包括：Cl INH、Factor I、C4BP、H因子、备解素等，为可溶性或以膜结合形式存在的一类蛋白，补体激活各环节均受到补体调节因子的精细调节。补体受体包括：CR1-CR5、C3aR、C5aR、fH受体等，表达于细胞膜，主要是免疫细胞膜表面，可与补体成分特异性结合发挥招募白细胞、吞噬清除病原微生物、清除免疫复合物等作用。补体系统在正常生理状态下以无活性酶前体形式存在，而当补体系统激活后产生级联放大反应，发挥不同生物学效应。目前明确的补体活化途径有3条，即经典途径、旁路途径和甘露聚糖结合凝集素途径[5]。经典途径因最早被发现而被命名，其通过抗原抗体复合物结合至C1q上启动，启动顺序为：C1qrs-C4-C2-C3-C5-C6-C7-C8-C9，活化过程需要两个关键转化酶，分别是活化C3的转化酶C4b2b，活化C5的C4b2b3b。旁路途径激活物为微生物或生物物质上的多糖、变性坏死组织细胞、变性蛋白聚集物、破坏后细胞碎片等，活化顺序为：C3-B-C3-C5-C6-C7-C8-C9，关键转化酶分别是活化C3的转化酶C3bBbp，活化C5的C3bBb3b。旁路途径又被称为第二途径、替代途径或者备解素途径，可以识别自己与非己，是机体补体系统重要的放大机制。MBL途径则是通过MBL蛋白结合到细菌细胞壁上MASP-1/MASP-2相关联的甘露糖或葡糖胺残基而活化，顺序为：MBL-MASP-C4-C2-C3-C5-C6-C7-C8-C9，关键转化酶分别是活化C3转化酶C4b2b，活化C5的C4b2b3b[6]。近来发现，凝血酶、凝血因子XIa、Xa、IXa、纤溶酶可以裂解C3、C5，产生C3a、C5a[7]，因为在该通路中，凝血酶起着决定性作用，故被命名为凝血酶途径。补体系统激活机制复杂，被不同的刺激因素启动，在不同器官、不同条件下经过不同途径激活。

2 细胞凋亡

细胞凋亡是指机体正常细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身程序，由基因控制，自主、高效、有序的细胞自主性死亡方式。当机体产生新生细胞的同时，突变和衰老的细胞必须启动凋亡机制而被清除，使组织和器官得以正常发育和代谢，在多细胞生物器官发育与组织分化，及维持机体内环境稳定和免疫调节中发挥极其重要的作用[8-9]。与补体系统活化一样，很多因素可以诱导细胞凋亡发生，主要有：物理性诱导因素，包括温度变化(超过机体体温的高温或者低温)、放射线照射(如紫外线、γ射线等)；化学因素，包括各种毒素、药物等；生物性因素，包括各种原因造成的缺血缺氧、外来微生物、DNA和蛋白质合成的抑制剂、活性氧、钙离子过载、视黄酸、正常生理因子的失调等[10]。这些诱导因素也如补体一样，通过不同信号转导途径启动凋亡程序。细胞凋亡信号转导途径包括：死亡配体途径、线粒体途径、内质网途径[11]。死亡配体途径也称为细胞外信号通路，由细胞外的配体通过与细胞上的死亡受体，主要是Fas、TNFRI结合，生成死亡诱导信号复合体，催化Caspase-8裂解成具有活性的Caspase-8，进而激活下游效应Caspase，特别是Caspase-3，造成细胞凋亡[12]。线粒体途径又称细胞内通路，各种诱因导致线粒体内线粒体通透性转运通道复合体开放，导致细胞色素C等物质释放，催化Caspase-9裂解成具有活性的Caspase-9而激活下游效应Caspase，而这一过程往往受Bcl-2家族调控[13-14]。内质网途径由内质网应激(ERS)引起，持续时间过长或严重的ERS都可促发凋亡发生。内质网主要通过Caspase-12介导ERS影响细胞凋亡[15]。

3 补体与细胞凋亡

研究发现，细胞凋亡产生的凋亡小体是补体经典活化途径的强激活剂[16]。

3.1MAC与细胞凋亡 攻膜复合物(Membrane Attack comPlexes， MAC)是补体活化后的终末产物，即C5b-9，有全溶解型和亚溶解型两类。前者可在细胞膜上形成非选择性亲水跨膜通道，小的可溶性分子、离子及水分子可自由透过胞膜，而蛋白质等大分子难以从胞浆中逸出，导致胞内渗透压降低，造成细胞溶破死亡。补体最早被认识，即因其介导细胞、细菌和病毒溶解，调理吞噬，在机体抵御病原体感染时发挥防御作用，该功能主要靠全溶解型MAC实现。现在发现MAC除了可“杀细胞”外，还有多种生物学效应，包括诱导产生氧自由基、细胞因子、黏附分子等，这些效应统称为MAC细胞非致死效应，这时MAC也被称为亚溶破MAC。

全溶解型MAC可插入细胞膜形成跨膜通道，诱导细胞裂解死亡，当MAC数量不足以引起细胞死亡时，仍伴有钙离子内流，细胞内钙超载，激活细胞凋亡程序。而sMAC已经在不同疾病证实可导致细胞凋亡[17]，经溶破剂量的C5b-9，即sMAC，诱导组织损伤，发现C5b-9上调ERK-1和ERK-2的活性，增强p21和DNA损伤因子的表达，DNA出现损伤，凋亡加速，并发现sMAC主要通过Caspase途径诱导靶细胞凋亡[18]。在Thy-1肾炎病变的前期，肾小球部分GMC表面可见补体C5b-9复合物的沉积，而此时细胞形态完好并未溶解，但有些细胞却发生了凋亡，推测sMAC参与了大鼠Thy-1肾炎GMC的凋亡病变,进一步研究发现，sMAC可以上调P300及干扰素调节因子-1的表达，通过X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)导致Thy-1肾炎GMC凋亡[19-20]。另有研究认为，MAC可同时诱导细胞死亡和凋亡。

3.2C5a与细胞凋亡 C5a是补体激活的中间产物，人类的C5a包含74个氨基酸，由C5转化酶切除C5的a链释放而来。C5a、C4a、C3a均为补体裂解片段中的过敏毒素，但C5a是作用最强的过敏毒素，分别为C3a和C4a作用的20倍和2500倍。C5a还可释放组胺，这一作用可不依赖于肥大细胞，而是通过直接作用于血管内皮细胞而增加血管的通透性，刺激平滑肌收缩。高浓度的C5a还是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞的趋化剂，可诱导这些细胞顺浓度梯度方向移动[21-22]，并刺激中性粒细胞和单核细胞的氧化代谢，提高其cGMP水平，促进溶酶体与细胞膜融合，释放大量溶酶体酶，同时刺激中性粒细胞黏附及增强其产生超氧化物的能力。另外，C5a对免疫应答有增强作用，诱导单核细胞分泌白介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，促进T细胞增殖及B细胞产生抗体[23]。

C5a对细胞凋亡也有影响[24]。C5a必须与C5aR结合才能发挥作用，C5a诱导细胞凋亡的作用也始于其与胞膜上C5aR的结合。有研究发现，C5a与胸腺细胞上的C5aR结合后诱导脓毒症大鼠胸腺细胞凋亡，但不能诱导正常大鼠胸腺细胞凋亡[25]。Guo等[26]在CLP致脓毒症大鼠模型中，给予抑制剂阻断C5a的作用，发现胸腺细胞的凋亡几乎消失，Bcl-XL水平基本保持正常，而胸腺细胞中Caspase的激活几乎完全被抑制，提示C5a可能通过线粒体通路促进胸腺细胞凋亡。Calpain是钙依赖性的半胱氨酸蛋白酶，可以将Bcl家族成员、AIF、转录因子、Caspase-12等裂解而参与凋亡的调节[27-28]。有研究使用C5a刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)后，胞浆m-calpain的含量增加，并包含很多活性片段，其时相性变化与该细胞凋亡率一致，而calpain特异性抑制剂PD150606可通过抑制m-calpain的激活降低AT-Ⅱ的凋亡率[29]。但C5a对细胞凋亡的影响是双向的，既可促进细胞凋亡又可延迟细胞凋亡，涉及的凋亡信号转导十分复杂，并认为这与不同细胞、不同条件有关。C5a与C5aR结合可以延迟中性粒细胞的凋亡，且跟C5a的浓度及作用时间呈正比[30]，并发现中性粒细胞凋亡被不同通路抑制[31]。C5a可通过PI3K、ERK路径使X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)表达及Bad磷酸化而抑制PMN的凋亡[23,32]，还能够增加细胞中cAMP的水平导致PMN凋亡延迟[33]。Knepper-Nicdai等[34]报道，calpains可协同Caspases促进中性粒细胞凋亡，且处于PMN多种功能及细胞凋亡的核心，而C5a可通过调节calpains活性并延迟 PMN的凋亡。

3.3C3a与细胞凋亡 C3a也为补体过敏毒素C3a，是补体活化过程中产生的活性片段，通过与其特异的受体C3aR结合而发挥功能[35]。C3aR作为补体系统的成员，在血液细胞巨噬细胞、T淋巴细胞及内皮细胞和血管平滑肌细胞都有表达。研究发现，C3a同样可以诱导细胞凋亡。将C3a作为刺激物加入人巨噬细胞共培养，结果显示随着补体C3a作用浓度的增加，时间的延长，人巨噬细胞凋亡率下降[36]，其对细胞凋亡也具备双向调节作用。有研究发现，补体C3是脑内具有生物活性的补体，激活后变为C3a，抑制巨噬细胞凋亡，释放更多IL-1β、TNF-α、前列腺素等，导致内皮细胞发生凋亡[37]。

3.4CD59与细胞凋亡 补体激活过程伴随补体蛋白的调控，包括可溶性及膜结合性，其中膜结合性补体蛋白能够与不同补体成分作用，使补体激活和抑制处于平衡状态。CD46、CD55及CD59是目前研究最多的膜结合蛋白，其中CD59作用尤其重要。CD59是目前发现的唯一作用于补体终末阶段的补体调节蛋白，通过干扰C8和C9相互作用、C9多聚化或C9插入到细胞膜内，从而阻止MAC形成；另外可以作为CD2的天然配体，参与T细胞的激活与黏附。

CD59作为补体调节蛋白，近年发现在很多肿瘤中高表达，认为高表达的CD59可以促进肿瘤细胞增殖，抵抗补体防御功能。进一步研究发现肿瘤的失控性生长与肿瘤细胞的抗凋亡有关，其中CD59分子对肿瘤细胞的凋亡发挥重要调节作用[38]。有研究将CD59特异位点的短肽封条作用于HeLa细胞和转CD59基因的HeLa细胞，24 h后检测Survivin、Caspase-3及其Bax的表达水平[39]。Survivin基因是目前已经发现的被认为最强的凋亡抑制基因。有研究显示，Survivin表达降低，而Caspase-3表达水平增高，Bax的表达无明显变化，提示抑制CD59可通过下调Survivin的表达并活化Caspase-3促进HeLa细胞的凋亡，证实其能抑制HeLa细胞的凋亡。另有研究将CD59的活性位点，第40位氨基酸进行突变,使之失掉第40位色氨酸密码子UUG，并将重组质粒成功转染至Hela细胞，发现Hela细胞凋亡增加，Caspase-3表达量也增加，提示CD59引起肿瘤逃逸的可能途径是通过抑制凋亡相关因子Caspase-3，通过封闭或敲除CD59的活性位点，Caspase-3活性增强，促使肿瘤细胞凋亡[40]。还有研究认为,CD59作为补体调节蛋白，可通过调控MAC的生成间接抑制凋亡，通过下调MAC的合成及TNF-α等的释放，抑制靶器官细胞凋亡。但是也有研究发现CD59可以促进一些细胞的凋亡，研究发现CD59可以与特异的单克隆抗体交联，导致钙离子内流，造成胞浆内钙超载，钙离子浓度升高，线粒体摄取过量钙离子导致线粒体损伤，细胞色素C释放，活化Caspases，诱导细胞凋亡[41]。

3.5C1 INH与细胞凋亡 C1酯酶抑制剂(C1 Inhibitor ，C1 INH)是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，为高度糖基化的单链糖蛋白，由478个氨基酸残基组成，分子量约为104 kDa，在体内主要由肝脏合成，其他细胞(如单核细胞、巨噬细胞、血小板等)也可以合成[42]。C1 INH是目前发现的补体蛋白C1唯一抑制剂，通过与丝氨酸蛋白酶C1 s和C1r作用而抑制补体活化，从而调节补体经典活化途径，另外还发现其还可以抑制C3b与B因子结合，从而调节补体的旁路途径[43]。C1 INH还能够抑制缺氧状态下内皮细胞凋亡，研究证实C1 INH可通过抑制心肌细胞补体C3表达，抑制过氧化氢导致的培养心肌细胞凋亡[44]。体内研究也发现其对缺血后再灌注心肌细胞凋亡有明显抑制作用。在结扎大鼠冠状动脉前5 min尾静脉注射C1 INH，发现心肌细胞凋亡明显减少，认为其抑制了补体系统激活而减少心肌梗死面积，改善心功能[45]。

4 小结

补体激活及细胞凋亡是机体正常生理活动，对维持机体内环境稳态发挥重要作用，如果补体过度激活，细胞不受限制凋亡则引发病理生理过程，导致疾病发生。已有研究证实二者相互影响，共同参与疾病的进程。

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