线粒体内Ca2+作用的研究进展

郭玉婷,王静知,程德殊,余珏珂综述,徐 冶审校

(吉林医药学院:1.临床医学院，2.基础医学院,吉林 吉林 132013)

线粒体是细胞的“能量工厂”，能够合成大量腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)为细胞供能。线粒体基质Ca2+的浓度能够影响丙酮酸脱氢酶的酶活性调节ATP的产生，从而调控能量代谢。线粒体Ca2+的摄取和释放也对细胞的自噬与凋亡产生影响。正常状态下，线粒体通过线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablize transition pore,MPTP)、线粒体单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)缓冲胞浆内Ca2+浓度。线粒体内的Ca2+浓度升高会使内膜上的钠钾锂转运体(Na+/Ca2+Li+-permeable exchanger,NCLX)活性增强、MPTP开放，释放线粒体内Ca2+。若Ca2+过量堆积，则会产生活性氧，引起细胞的凋亡和坏死。在细胞应激状态下，线粒体Ca2+浓度的升高会引起线粒体自噬，这种自噬对细胞起到保护作用，维持细胞的生命活动[1]，持续应激下Ca2+会过量堆积导致细胞死亡。

1 线粒体的Ca2+调节

1.1 线粒体的Ca2+摄取途径

线粒体是第一个被发现参与Ca2+转运的细胞器，早在20世纪中期，科学家们就发现了离体的线粒体可以摄取Ca2+。现在，人们认为线粒体可以通过两种不同的动力学模式的单向转运机制摄取Ca2+。目前，JAKOB等认为心肌细胞和神经细胞主要是通过MCU和线粒体雷诺丁受体(ryanodine receptor,RyR)摄取Ca2+[2]。

Ca2+单向转运体的分子特性几十年来一直是个谜，直到发现了一种新的蛋白MCU。敲除MCU几乎完全抑制了离体线粒体对钙的摄取，显著减少了完整细胞中线粒体的Ca2+摄取。此外，使用膜片钳检测发现敲除MCU抑制了钌敏感的Ca2+电流。据此，推测MCU蛋白是负责调节Ca2+的摄取。目前，线粒体的内膜(inner mitochondrial membrane,IMM)上的MCU已被确立为线粒体Ca2+摄取的关键分子[3]。MCU是具有电生理特性的离子通道，通过MCU流入的Ca2+受电子传递链产生的IMM的电化学梯度驱动。MCU和MCU调节相关的分子共同组成完整的调节Ca2+摄取的复合物。这种MCU调节分子包括基础MCU调节因子、线粒体钙离子摄入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1,MICU1)和MICU2[4]，它们在MCU摄取Ca2+时发挥着十分重要的作用。

有趣的是，许多研究均表明沉默MCU能够显著减少线粒体内Ca2+的摄取，但是HOLMSTROM和PAN等却分别在MCU沉默的小鼠细胞线粒体中检测到了大量的Ca2+[5-6]。这些结果表明MCU不是线粒体摄取Ca2+的唯一途径。PAN等还发现，在没有MCU的动物中线粒体Ca2+只是部分减少，表明MCU不是线粒体吸收Ca2+的唯一机制[7]。对这一现象最简单的解释是线粒体像其他细胞膜一样，存在多种Ca2+转运的机制。

1.2 线粒体的Ca2+释放途径

线粒体内的Ca2+堆积会使NCLX增强。NCLX是Na+依赖的钠钙反向交换通道，能够正向调节线粒体内Ca2+外流。这种Ca2+的转运可以被地尔硫卓、氯硝安定及苯并硫氮杂卓类化合物抑制，其中CGP-37157最为常用[8]。

当线粒体内Ca2+浓度过高时，会引起膜上的MPTP开放[9]。MPTP的开放受线粒体内Ca2+浓度的影响，低膜电位也可增加其开放率，关闭则受pH等因素影响。MPTP具有一个重要的性质：MPTP开放引起的ADP增加和Mg2+/Ca2+的恢复是可逆的。这种可逆性决定了MPTP有持续和瞬时两种开放模式，可以启动细胞死亡的信号通路或维持细胞正常的功能[10]。最近NI等表明细胞质中的钙蛋白酶1过表达可以显著增加活性氧的产生，指出了调节MPTP开放的可能机制[11]。有实验表明钙蛋白酶1在神经细胞兴奋性中毒或心肌细胞H9C2氧化应激时能够截断糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)。GSK-3β通过移除去磷酸位点Ser9、Thr390之一或全部被高度激活，GSK-3β的抑制有利于再灌注，而再灌注时导致钙蛋白酶活化，加重线粒体Ca2+超载，引起细胞死亡[12]。因此，HURST等猜测截断线粒体的GSK-3β会过度活化钙蛋白酶1促进亲环蛋白D的磷酸化，进而引起MPTP持续的开放以抵制钙蛋白酶1引起的细胞死亡[13]。越来越多的证据表明，Ca2+是调节MPTP孔的中枢，可以直接调节MPTP本身，也可通过调节ADP/ATP平衡、线粒体跨膜电位(ΔΨm)、活性氧/活性氮水平和蛋白水平对MPTP进行调控。

此外，线粒体还存在H+/Ca2+反向转运通道蛋白Letm1(leucine zipper EF hand-containing transmembrane protein 1)。线粒体基质中Ca2+浓度较低时，Letm1可转运Ca2+进入；反之，转运Ca2+流出。脂质体纯化的重组蛋白研究表明Letm1促进K+依赖性的电中性的H+/Ca2+交换[14]。值得注意的是，沉默Letm1，尽管在MCU的存在下，依然可以抑制Ca2+的内流[15]。

2 线粒体Ca2+与细胞能量代谢

线粒体能为细胞的各种生命活动提供能量，其基质内含有三羧酸循环的全部酶类，内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体，是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所。Ca2+作为第二信使可以调控离子通道、酶和基因的表达，几乎参与了细胞内所有的生理活动[16]。细胞能够通过细胞器Ca2+摄取和释放的信号通路来实现Ca2+信号编码整个细胞的生命活动信息。线粒体通过缓冲胞浆中Ca2+浓度参与了这个调控过程并起到重要的作用。线粒体是双层膜细胞器，能够将胞浆中大量的Ca2+转移至线粒体基质。线粒体基质Ca2+浓度增高时，Ca2+能够与无机磷酸盐或其他形式的磷酸盐形成复合物起到缓冲作用，以便胞浆中的Ca2+继续转移至线粒体。同时，线粒体摄取Ca2+能够活化基质酶，通过激活丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶增加ATP的产生，调节能量代谢[17]。此外，线粒体的Ca2+浓度在神经元功能中也起着一定的作用[18]。如在亨廷顿病和阿尔兹海默病等神经退行性疾病中，线粒体钙稳态受损是神经元损伤的基础[7]。

3 线粒体Ca2+与自噬

自噬的主要生理功能是吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并将其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，从而加强蛋白质质量、能量的控制，维持细胞稳态。在各种类型的生理应激(如营养缺乏、缺氧、病原体感染等)或药物负荷的影响下会引起自噬的上调。在这种情况下，细胞主要是通过自噬来对抗刺激，使自身存活。因此，自噬受损会导致癌症和神经退行性障碍等疾病的发生。

自噬的本质是细胞为了存活而产生的应激，但持续的应激会引起细胞死亡，其过程也受Ca2+调控。在哺乳动物细胞中，内质网是储存Ca2+的主要细胞器，在胞内Ca2+信号传导通路中起着关键性的作用。内质网Ca2+的储存和释放主要取决于内质网Ca2+泵对Ca2+的摄取[19]，和肌醇三磷酸受体(inositol trisphosphate receptor,IP3R)、RyR对Ca2+的释放[20]。尤其是IP3R诱导的Ca2+释放在细胞自噬和凋亡中的作用已被证实[21]。在线粒体与内质网紧密连接处，Ca2+可以从内质网依次经由IP3R和电压依赖性离子通道流入线粒体。线粒体中Ca2+若积聚过多则会造成钙超载，导致细胞死亡。线粒体相关内质网膜是内质网和线粒体之间Ca2+传递必不可少的结构，也为两细胞器之间的相互作用提供了的平台。内质网到线粒体低水平的Ca2+传导是能量产生的基础。如果Ca2+转移至线粒体的过程受阻，ATP产生会随之减少，造成细胞内AMP/ATP比率上调，单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated kinase，AMPK)活化，活化的AMPK通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1或直接激活unc-51样激酶1/2复合物触发自噬[22]。此外，饥饿条件下，线粒体内质网结合位点会优先形成自噬体。若敲除内质网线粒体连接处的蛋白如线粒体融合蛋白2，会减少自噬体的形成[1]。

线粒体与内质网的紧密连接在线粒体自噬中有着重要的调节作用。在哺乳动物的成纤维细胞中，电子传递链的突变会引起一个变化：线粒体Ca2+摄取减少，但线粒体仍处于静息电位且形态正常[23]。线粒体Ca2+摄取减少是由于线粒体与内质网连接处减少和MCU复合物的位置被改变而减弱了其摄取Ca2+的特性。因此，基于线粒体与内质网的紧密连接有利于线粒体自噬和线粒体生物合成，线粒体相关内质网膜会为细胞提供有效的促存活机制[24]。

4 线粒体Ca2+与细胞凋亡

线粒体是把营养物质转化成ATP的主要细胞器，IMM与线粒体外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)的结构是这个功能发挥的基础，其通透性的改变也影响着细胞的凋亡与否。OMM可允许高达分子量5000的分子通过，IMM则通透性极低，这种性质是化学电位产生的基础，也是氧化磷酸化和ATP产生所必需的。IMM的通透性在线粒体触发和调节凋亡过程中似乎起着关键性的作用。线粒体的MPTP复合物能与IMM上的腺苷酸转运体(adenine-nucleotide-translocator,ANT)结合，ANT与电压依赖性阴离子通道形成内外膜的连接[25]。应激状态下，IMM通透性增加，允许分子量小于1500的分子(包括质子)自由通行，质子进入线粒体基质，阻断氧化磷酸化作用。此外，还会导致线粒体基质渗透性肿胀，內嵴折叠压缩囊泡。同时，OMM通透性增加导致促凋亡蛋白如细胞色素C、凋亡诱导因子核酸内切酶G释放到细胞质中，这最终将导致胱天蛋白酶依赖性和非胱天蛋白酶依赖性的细胞凋亡。

线粒体不仅能为细胞提供大量能量，作为胞内钙库之一也能通过调控Ca2+浓度来调节细胞的存活与死亡[26]。在细胞受到一定刺激下，可活化磷脂酶C水解磷脂酰肌醇4,5-双磷酸，生成肌醇三磷酸(inositol triphosphosate，IP3)和二酰甘油。IP3可以结合内质网上的IP3R，激活Ca2+通道，使Ca2+从内质网流到胞浆。进而引起线粒体对Ca2+的吸收，又可以通过NCLX进行释放，维持细胞内Ca2+的稳态。若线粒体钙超载则会损伤线粒体，激活细胞色素C,活化胱天蛋白酶3诱导细胞凋亡[27]。Ca2+在开始和完成凋亡途径的细胞死亡过程也是至关重要的[28]。线粒体Ca2+的积累可以调节IMM上MPTP的开放，其伴随着渗透性肿胀和线粒体膜的破裂，将会造成促凋亡因子如细胞色素C释放到细胞质中。Ca2+在凋亡中的另一个作用是通过Ca2+介导的蛋白磷酸酶活化使Bad蛋白去磷酸化，并从胞浆向线粒体转位，阻断Bcl-2家族蛋白Bcl-xl的抗凋亡作用[12]。此外，被钙蛋白酶裂解的Bid蛋白也可以通过截短Bid触发线粒体途径的凋亡[13]。

5 结 语

Ca2+通过各种机制穿梭于线粒体、内质网和细胞质之间，调节着细胞的生理活动。线粒体通过MCU、RyR等摄取Ca2+，通过NCLX、MPTP等释放Ca2+，调节着自身与胞内的Ca2+浓度，维持着Ca2+稳态。而细胞内Ca2+稳态失调是细胞死亡过程中普遍存在的现象。线粒体作为细胞死亡途径的核心，在细胞应激状态下，通过对Ca2+的摄取和释放调节细胞凋亡与自噬，且在Ca2+缓冲过程中起到至关重要的作用。线粒体的结构和功能比较复杂，并处于不断地融合、分裂的动态过程中，和各个细胞器之间联系密切。目前，对于影响线粒体内Ca2+升高和降低因素的了解还不是很全面，有必要深入研究线粒体内Ca2+的传导机制，以期更好地诠释线粒体相关临床疾病，为其提供新的线索。

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