单胃动物肠道细菌群落及其产臭机制研究进展

钟智康，王 燕,2*，吴银宝,2，廖新俤,2

(1.华南农业大学 动物科学学院，广东 广州 510642；2.华南农业大学 农业部生态农业重点开放实验室，广东 广州 510642)

畜禽臭气不仅影响畜禽健康和降低生产性能，还会影响周边居民与养殖场工作人员的健康和生活质量[1]。研究表明，肠道细菌群落与臭气的产生有关[2-5]。本文以我国存栏量与出栏量最高的单胃动物——猪和鸡为模型[6]，通过了解肠道细菌群落的种类、性质、影响因素及其在产生臭气物质过程中的作用，分析单胃动物肠道细菌群落与臭气产生的关系，阐明臭气产生的机制，为有针对性地研究与选择臭气减排调控措施提供理论基础。

1 单胃动物肠道细菌群落结构

1.1 肠道细菌群落的定植

肠道内细菌群落在单胃动物的整个生长期间，呈一定的变化规律性[7]。一般认为，微生物在猪肠道内的定植始于胚体阶段，胚体通过吞饮母体羊水获得胃肠道微生物[8]，而刚孵化的雏鸡则是肠道无菌的[9]。初生动物接触外界环境，微生物进入肠道并开始定植到形成稳定的肠道细菌群落是一个复杂的动态过程。初生动物胃肠道内充满氧气，首先由需氧菌及兼性厌氧菌如：肠杆菌、链球菌和葡萄球菌等在肠道定植，它们消耗肠道中的氧气，造成pH降低和厌氧环境，为专性厌氧菌的定植和生存提供了一定条件。随后厌氧菌如：乳酸杆菌和双歧杆菌开始定植[10]，形成以厌氧菌占大多数的复杂而稳定的肠道细菌群落。猪和鸡肠道中的优势菌为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，三者共占肠道细菌群落总数的90%以上[11-12]。动物的肠道细菌群落发育成熟是从短时间的单一结构向复杂逐渐演变的过程[13]。

1.2 各肠段细菌群落多样性的差异

动物肠道内的细菌群落组成有明确界限。宏基因组比较分析表明小肠和大肠细菌群落的多样性和物种丰度存在显著差异[14-15]，其原因与小肠在生理上主要进行营养物质的消化吸收而大肠主要起发酵和水分重吸收的作用有关。相应地，小肠细菌群落在小分子营养物的代谢中起重要作用，而盲肠细菌群落有超过200种不同的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides, NSP)降解酶[16]，具备更强的降解木聚糖、果胶和纤维素的能力。

从十二指肠到盲肠，随着pH逐渐增加和氧气含量不断减少，厌氧菌相对丰度、细菌数量和相对多样性随之不断增加[17]。盲肠具有pH较高、高度厌氧和内容物停留时间最长(12～20 h)的特点，创造了利于微生物增殖与发酵的环境，所以盲肠内容物具有肠道中最高的微生物细胞密度，为1010～1011个/g，且以厌氧菌为主[18]。盲肠是微生物发酵有机物产生臭气的重要场所，也是臭气减排研究的主要对象[19-20]。猪和鸡小肠相对丰度最高的两个门类细菌是壁菌门和变形菌门，盲肠相对丰度最高的两个门类细菌是厚壁菌门与拟杆菌门，在属水平上，大肠细菌群落的相对丰度与多样性显著高于小肠[21-22]。关于鸡和猪的小肠与大肠在属水平上的优势细菌群落报道不尽相同。据报道，鸡小肠细菌群落以乳杆菌属为主，占细菌群总量的80%～90%，其余部分主要由肠杆菌属与肠球菌属组成[23]。但也有报道认为鸡小肠细菌群落以乳杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属和肠球菌属为主，而大肠以梭菌属、拟杆菌属和梭杆菌属为主[18,24]，猪的小肠优势细菌群落为双歧杆菌属、乳杆菌属和肠球菌属，大肠优势细菌群落为梭菌属与双歧杆菌属[25]，但也有研究表明，猪的小肠以埃希氏菌属、不动杆菌属和肠杆菌属为优势细菌群落，而大肠则以梭菌属和瘤胃球菌属为优势细菌群落[26]。不同研究结果的属水平优势细菌群落差异可能与动物品种、日粮与日龄有关。

2 影响单胃动物肠道细菌群落的因素

2.1 品种和年龄因素

宿主的遗传因素对肠道细菌群落多样性的组成差异有不可忽视的影响力[27]。有研究对比不同品种蛋鸡的肠道细菌群落与臭气排放的关系，发现不同品种蛋鸡的臭气产生量差异与肠道细菌群落组成不同有关[28]。对两个存在遗传差异的肉鸡品系进行肠道细菌定植和发育研究，结果也表明遗传背景能影响肠道细菌组成，遗传差异对肠道细菌群落组成差异的影响随着时间推移逐渐明显[29]。

年龄同样能影响肠道细菌群落的多样性，单胃动物从出生时肠道处于无菌或少菌的状态发展至成熟的肠道细菌群落是一个动态过程。Zhao等[26]研究猪肠道微生物在不同年龄段的变化，发现随着年龄的增长，细菌群落多样性显著增加，整个生长阶段拟杆菌门丰度都呈现出动态变化的过程，且成年猪肠道中的厚壁菌门相对丰度显著高于1月龄猪。

2.2 饲养模式

饲养模式是影响畜禽肠道细菌群落组成的重要外部环境因素。研究表明，在自由放养和笼养这两种饲养模式下，大骨鸡盲肠细菌群落的多样性和功能之间存在显著差异[30]。不同饲养模式对肠道细菌群落相似性的影响从肠道近端到远端逐渐增大，即不同饲养模式对大肠的细菌群落影响最大[31]。不同饲养模式导致肠道细菌多样性差异的主要原因在于，笼养一类集约化饲养模式下，饲养密度较高，动物往往处于长期应激状态，会降低肠道细菌的丰度和多样性[32]，另外，在动物能直接接触外界环境的自由放养模式下，动物经垫料和土壤等摄入大量的微生物，增加了肠道微生物的丰度和多样性。

2.3 日粮组成

通过调控日粮的蛋白质与纤维素比例是改善单胃动物肠道细菌群落从而达到减少臭气排放的一种有效措施。当日粮中含有适当比例的纤维素时，日粮纤维在减少氨气排放和改善肠健康方面发挥重要作用。盲肠细菌群落发酵日粮纤维素，能产生短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)，SCFAs降低肠道pH，利于肠道中有益菌的生长并抑制有害菌的增殖[33]。同时纤维素能刺激微生物增殖，增强细菌对氮的同化作用和利用氨基酸合成蛋白质的能力，促进不稳定的铵态氮和尿素氮转化成较为稳定的细菌蛋白氮，减少氨气的排放。当前普遍存在着畜禽饲料粗蛋白含量过高的现象，多余部分的蛋白质被大肠杆菌和产气荚膜梭菌等有害菌发酵产生有害气体。研究表明，适当降低日粮粗蛋白含量，同时补充必需氨基酸，能有效减少有害菌，降低尿素、氨气和总氮排泄量[34]。适当降低饲粮粗蛋白水平(20.00%降至15.30%)，能显著增加猪后肠细菌群落多样性和有益菌数量[35]。大量研究表明，适当降低粗蛋白水平和增加纤维素含量并不影响畜禽的生长性能和胴体质量，同时起到减排氨气的作用[36]。

随着饲料加工工艺的进步，更多的新型日粮被应用于畜禽生产，主要包括发酵豆粕和液态发酵饲料等。发酵豆粕是指将豆粕进行微生物发酵处理，去除豆粕中的抗营养因子，并降解大分子蛋白质生成小肽，同时还生成多种益生菌和有益微生物代谢产物，得到具有多种功能的优质蛋白饲料[37]。日粮中添加10%的发酵豆粕能显著降低肠道pH，抑制有害细菌如大肠杆菌的增殖和降低氨气排放[38]。液态发酵饲料是指将饲料原料与水按一定比例(1∶1.5～1∶4)混合，经充分发酵后形成稳定状态的液体饲料。液体发酵饲料能显著降低动物胃肠道pH，并防止病原体如大肠杆菌和沙门氏菌在胃肠道中增殖，减少氨气排放[39]。但新型日粮存在生产技术与利用仍不成熟的缺点，并未大量投入使用。

2.4 饲料添加剂

2.4.1 微生态制剂 微生态制剂是在微生态学的理论指导下，调整微生态失调、保持微生态平衡、提高动物健康水平或增进健康状态的益生菌及其代谢产物和生长促进物质的制品。微生态制剂包括益生元、益生菌和合生元。

益生元是指宿主不能消化吸收，但可以被肠道菌群发酵的食物成分，它能特异性地刺激有益菌的生长和代谢活动。在畜禽生产中应用的益生元主要是非消化性的可发酵碳水化合物，包括低聚糖类和NSP。低聚糖包括低聚木糖、低聚半乳糖和低聚甘露糖等，而NSP根据其结构特点，主要分为纤维素、半纤维素和果胶多糖，而目前被归类为益生元的NSP主要是菊粉[40]。研究表明，在基础日粮中添加0.2%的乳果糖，能有效降低鸡肠道中的大肠杆菌比例并增加乳杆菌的比例，减少氨气和硫化氢的排放，改善生产性能[41]。在日粮中补充适量菊粉，有利于双歧杆菌和乳杆菌的快速增殖并抑制致病微生物的生长[42]。但大多数益生元具有一定的抗营养性作用，使用时应注意添加量。

益生菌是定植于宿主肠道，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。在肉鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌C-3102能抑制大肠杆菌、产气荚膜梭菌和沙门氏菌一类有害产氨菌的增殖，有利于乳杆菌增殖并改善肠道微生物菌群，减少氨气排放[43]。添加益生菌能促进非淀粉多糖的发酵，产生的有机酸能降低肠道内pH，抑制病原菌增殖，减少臭气。但益生菌制剂由于具有菌种组成及比例的不确定性和在肠道内外环境的不稳定性等缺点，使其推广受限。

合生元指益生元和益生菌复合的生物制剂。研究发现，果寡糖和益生菌配合使用对肠道细菌群落的改善和氨气减排效果显著优于单独使用果寡糖或益生菌，呈现出协同效应[44]。但有研究表明，益生菌和寡糖合用对肠道细菌群落的改善效果不如单独添加显著[45]。说明合生元是否能呈现协同效果与复合益生元和益生菌的种类及其复合比例有关。

2.4.2 酶制剂 饲料中往往存在部分物质不能被单胃动物胃肠道分泌的内源性消化酶有效降解或者完全不能被降解，例如NSP和植酸等。饲料中添加酶制剂可以促进部分难消化营养物质的降解，提高饲料的利用率。常用的饲料酶制剂有植酸酶和NSP复合酶(一般包含有木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶等)。

植酸具有抗营养作用，植酸与蛋白质或其他营养物质能结合成难以被动物小肠消化吸收的复合物，使进入后肠被微生物发酵的蛋白质增加，产生的氨气随之增多，加重内源氮的损失。植酸酶可以促进植酸分解，减少蛋白质进入后肠，从而发挥调控肠道微生物菌群，降低微生物发酵蛋白质产生臭气的作用[46]。NSP是单胃动物饲料的主要成分之一。NSP酶制剂催化多糖降解生成的功能性寡糖能刺激乳酸菌、双歧杆菌等益生菌增殖，产生的有机酸能抑制大肠杆菌等病原菌，改善肠道细菌群落。此外，NSP酶制剂还能降低食糜黏度，加快食糜的排空速度，减少有害菌利用食糜营养物质产氨的时间。研究表明，日粮中添加NSP复合酶可以降低23%氨气产量[47]。但酶制剂的使用效果容易受到pH、温度和运输条件等因素的影响，限制了应用推广。

2.4.3 酸化剂 酸化剂从性质上分为有机酸(柠檬酸、乳酸和丁酸等)和无机酸(磷酸)，它具有调控动物肠道微生物平衡、增殖有益菌、抑制有害菌、提高消化酶活性和营养物质消化率等功能[48]。研究发现，在日粮中添加缓释复合酸化剂，能有效抑制大肠杆菌并促进乳酸菌增殖，降低舍内氨气浓度[49]。乳酸和磷酸的复合酸化剂能降低肠道pH，提高小肠消化酶活性从而减少蛋白质进入后肠发酵产生臭气，促进双歧杆菌的增殖并抑制大肠杆菌[50]。但由于饲料具有酸结合能力与含有碱性物质，会影响酸化剂的效果，而且酸化剂释放过快无法在后肠发挥作用，虽然包被技术可以解决以上问题，但包被的成本较高。此外，不同种类和配比的酸化剂对动物肠道微生物区系的影响也不尽相同，在使用时需要根据实际情况考虑酸化剂的种类与配比。

2.4.4 植物提取物 植物提取物指从植物中获取的能添加到饲粮中，促进畜禽生长的安全无污染的绿色添加剂。植物的提取物成分是其次级代谢产物，主要包括黄酮类、生物碱类、糖苷类、甾体类、萜类、醌类、苯丙素类、脂质类和挥发性油类等多种类型[51]。植物提取物具有抗菌活性，添加到饲料中能抑制有害菌增殖，改善肠道微生物菌群[52]。研究发现，樟树和丝兰属植物提取物能抑制细菌脲酶活性，减排氨气[53]。大蒜素能抑制脲酶产生菌增殖和脲酶活性，减少动物体氨气排放[54]。可见植物提取物具有改善肠道微生物菌群和减排臭气的功能，但也存在成本较高、原材料来源不稳定、作用与代谢机制不明、缺乏产品使用和参照标准等问题。

3 单胃动物体主要臭气及其产生机制

未消化的纤维素、脂质和部分未被小肠吸收的蛋白质与内源性分泌物进入大肠被微生物发酵产生臭气[55]。

3.1 臭气的组成

动物体臭气根据其化学性质特点一般分为四类：氨和挥发性胺类、挥发性含硫化合物类、吲哚类和酚类、挥发性脂肪酸(volatile fatty acids, VFAs)[56]。氨气在臭气物质中所占的比例最高，危害较大[40]。肠道中的一部分氨气被微生物用作氮源合成蛋白质，但大部分氨气被排出体外，释放到空气中。挥发性含硫化合物类主要有硫化氢、硫醇类、硫醚类等，臭气中的硫化氢含量仅次于氨[57]，而且含硫化合物的臭气检测阈值都比较低(臭气检测阈值：人对臭气成分能感到有臭味的最低浓度，臭气阈值越低，在相同浓度下其引起的臭味强度越强)。吲哚类和酚类主要包括粪臭素、对甲酚、4-乙基酚和苯乙酸等，其臭气阈值均较低。VFAs以臭气阈值较高的乙酸、丙酸和丁酸为主，另外还有部分阈值较低的长链和支链脂肪酸如戊酸、己酸和异戊酸等。

3.2 臭气产生机制

动物体排放的臭气主要来源于细菌对有机物的发酵降解[40]。

3.2.1 碳水化合物型发酵 参与碳水化合物发酵的细菌以乳杆菌和双岐杆菌等一类有益菌为主。肠道细菌发酵碳水化合物存在分级利用的情况，即首先部分细菌发酵利用碳水化合物，产生的单糖和寡糖继续被其他微生物发酵利用，产生乳酸、琥珀酸和SCFAs等小分子化合物，其中乳酸和琥珀酸等小分子物质继续作为其他细菌的发酵底物，被进一步转化为SCFAs[58]，所以这些中间产物的含量一般较少。SCFAs(乙酸、丙酸和丁酸等)和气体(二氧化碳、氢气和甲烷)是肠道细菌群落碳水化合物型发酵的主要终产物[59]。

3.2.2 含氮化合物型发酵 一般情况下，肠道细菌主要通过酵解碳水化合物获能，而蛋白质则被细菌分泌的蛋白酶分解成肽类和氨基酸，再被同化合成菌体蛋白。远端大肠缺乏碳水化合物时，肠道细菌群落发酵氨基酸获能，并产生氨气、胺类、硫化氢、吲哚类、酚类和VFAs等物质[60]。发酵氨基酸的脱氨基和脱羧作用分别产生氨气和胺，另外细菌分泌脲酶能分解尿素产生氨气[5]。细菌发酵氨基酸产生VFAs，其中支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)产生相应的支链脂肪酸(异丁酸、戊酸、异戊酸等)[61]。细菌发酵芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)产生酚类和吲哚类[62]。含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)经细菌发酵产生硫化氢和甲硫醇[63]。因为氨气、酚类、吲哚类和挥发性含硫化合物对宿主是有害物质[4-5]，故一般认为肠道细菌的含氮化合物型发酵不利于宿主的健康。

3.2.3 两种发酵类型对臭气生成的影响 单胃动物体产生的臭气主要来自于含氮化合物的发酵，包括氨、挥发性含硫化合物类、吲哚类和酚类等有害气体。碳水化合物型发酵的代谢产物主要是4碳以内的SCFAs，臭气检测阈值较高，且大部分被宿主大肠吸收并为宿主供能，对动物体臭气排放的贡献值不大。另外，碳水化合物型发酵产生的大量SCFAs和其他有机酸能降低肠道pH，抑制大肠杆菌等产氨菌的增殖，减少臭气产生。当细菌以碳水化合物型发酵作为主要获能途径时，会大量同化含氮物质用于自身蛋白质的合成，减少了微生物对含氮化合物的异化作用，有利于养殖臭气减排。碳水化合物型发酵不仅产生的臭气物质较少，而且还能减少含氮化合物型发酵产生的臭气。因此，碳水化合物型发酵是理想的减少动物体臭气产生的肠道细菌群落发酵类型。使肠道细菌群落的发酵以碳水化合物型为主，减少含氮化合物型发酵的发生，是调控动物体臭气排放的重要思路。

4 细菌群类型与臭气产生的关系

氨气主要来源于细菌对氨基酸的脱氨基作用和脲酶对尿素的分解。克雷伯氏杆菌属和变形杆菌属具有较高的脲酶活性，是肠道中的主要尿素分解菌[64]。关于产生氨气的主要菌种，不同学者的研究结果不尽相同，包括如产气荚膜梭菌、志贺氏菌、大肠杆菌、克雷伯氏杆菌属、弯曲菌属、链球菌属、 艰难梭状芽胞杆菌和脆弱拟杆菌[55,65-66]，但对于何种细菌是主要产氨菌仍没有定论。

挥发性含硫化合物由两条途径产生，途径一是含硫氨基酸在肠道细菌的脱巯基酶作用下发酵产生[5]，该代谢能力并不是特定的某些细菌类型所特有。但目前已经证明大肠杆菌、幽门螺旋杆菌、沙门氏菌、梭菌属某个亚种和产气肠杆菌这一类大量存在于大肠中的细菌具有发酵含硫氨基酸产生挥发性含硫化合物的能力[5,67]，同时上述的细菌类型还跟氨气的产生有密切关系，可见上述病原细菌的发酵作用是臭气物质的重要源头。途径二是硫酸盐还原菌(sulfate reducing bacteria,SRB)在厌氧降解利用有机质时，还原硫酸根离子产生挥发性含硫化合物。肠道中大部分SRB属于Δ-变形菌纲的脱硫肠状菌属、脱硫叶菌属、脱硫杆菌属和脱硫弧菌属，其中以脱硫弧菌属的丰度最高[68]。

肠道中厌氧细菌降解芳香族氨基酸产生一系列吲哚类和酚类臭气物质[61]，其中发酵酪氨酸的主要产物是酚、对甲酚、苯丙酸和4-乙基苯酚，丙氨酸发酵的主要产物是苯乙酸和苯丙酸，而色氨酸发酵的主要产物是吲哚、吲哚丙酸和粪臭素。有研究表明大约10%的厌氧细菌能降解芳香族氨基酸产生酚类和吲哚类物质，它们包括拟杆菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属和消化链球菌属[69]。在酚类和吲哚类臭气物质中以粪臭素即3-甲基吲哚研究较多，但很少有菌株能产生粪臭素，目前已知6种肠道细菌与粪臭素的产生相关：粪味梭菌、疾病梭菌、假单胞菌、瑞士乳杆菌、乳酸杆菌1120和根瘤菌[70]。近来的研究发现嗜氨基酸梭菌、约氏乳杆菌、双胞梭菌和毛螺菌可能与粪臭素产生有关[71]。

单胃动物肠道细菌发酵日粮中的碳水化合物和含氮化合物产生VFAs，受细菌群落构成、发酵底物类型和肠道内pH等因素影响。拟杆菌门细菌发酵碳水化合物的主要终产物是乙酸和丙酸，而厚壁菌门的主要终产物则为丁酸[72]。种类众多的微生物能发酵碳水化合物产生SCFAs，但以双歧杆菌这一类优势菌为主。研究发现，当大肠中可发酵膳食纤维有限时，管腔pH增加到6.5，产丁酸细菌几乎完全消失，而产生乙酸和丙酸的相关拟杆属细菌则成为主导[73]，pH对SCFAs的产生有显著的影响。与发酵碳水化合物相比，细菌发酵含氮化合物产生更多的长链或支链VFAs，参与的微生物包括拟杆菌、真杆菌属、梭菌属、消化链球菌属等[40]。

5 展 望

臭气的排放已经成为单胃动物规模化养殖不可忽视的问题，动物体臭气主要由肠道细菌的发酵代谢活动所产生。单胃动物的大肠是发酵产臭的主要肠段，而盲肠又是其中臭气产生的主要位点，但大肠其他部分(结肠和直肠)的产臭情况缺乏相关的研究，需进一步研究。臭气的组成成分复杂，目前的臭气减排研究对象主要为氨气和硫化氢，所占比例少，但臭气阈值更低的粪臭素和甲硫醇对感官影响可能更大但研究较少，加强对粪臭素和甲硫醇的减排研究，或许能更好地降低养殖场臭气对人的感官影响。目前以营养途径调控臭气产生，因受诸多因素影响，难以保证营养调控措施的效果。单胃动物臭气的产生主要来源于肠道细菌的含氮化合物型发酵，可针对此特点调控肠道细菌群落进行动物体臭气减排。

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