猪肺炎支原体主要保护性抗原的研究进展

王文秀，王宝琴，徐晴晴，刘 博，张 艳

( 1.山东省滨州畜牧兽医研究院, 山东 滨州 256600; 2. 滨州学院生物工程学院, 山东 滨州 256600;3.海南省农业科学院畜牧兽医研究所, 海南 海口 571100)

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplsamal pneumonia of swine，MPS)的原发性病原，广泛流行于世界各地，对养猪业造成重大经济损失。猪支原体肺炎又称猪地方流行性肺炎(porcine enzootic pneumonia，PEP)，我国俗称猪喘气病[1]。MPS主要症状为咳嗽和气喘，病变的主要特征是肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈肉样和虾肉样实变[2]。

Mhp感染猪体后最初黏附于呼吸道纤毛表面，随后逐渐蚕食纤毛，直至纤毛大面积或全部脱落，纤毛脱落后，进入呼吸道的异物及器官黏膜产生的分泌物无法排出而沉降到支气管末端及肺泡中，逐渐形成肺实变，最终使肺脏功能遭到破坏，出现呼吸系统症状[3]。MPS本身致死率不高，但诱发的猪呼吸道病综合征(Porcine Respiratory Disease Comples，PRDC)的其他传染病，特别是免疫抑制性疾病，如猪繁殖与呼吸系统综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)等往往导致猪严重死亡，造成的经济损失巨大[4-5]。

Mhp对培养要求很高，在体外分离培养比较困难，目前完全测序的猪肺炎支原体共有4株(232株、7448株、J株、168株)，各株基因组全长约900 kb，含有约700个蛋白质编码基因[6]，其中约三分之一的基因编码菌体表面蛋白，但是目前仅有小部分蛋白的表达和表面定位有所研究和证实[8]。本文围绕Mhp部分黏附因子、膜蛋白及细胞质蛋白等主要保护性抗原蛋白进行综述，为MPS疾病诊断、监测和相关疫苗研究提供科学依据，对该病的预防和控制具有重要指导意义。

1 黏附因子

猪肺炎支原体侵入呼吸道后，识别呼吸道黏膜纤毛细胞的特异性受体，并在呼吸道繁殖，特异性黏附在猪呼吸道纤毛上，定殖于宿主细胞受体，为致病的关键因素，该过程离不开黏附因子的功能[9]。Mhp与猪呼吸道纤毛的黏附是多个黏附因子共同作用的结果，黏附机制还没得到证实。近几年，关于猪肺炎支原体黏附因子方面的研究有较多报道，发现黏附因子不但能够黏附猪呼吸道纤毛，而且还具有结合肝磷脂、纤连蛋白和血纤维蛋白溶酶原等功能，这些功能与猪肺炎支原体致病过程息息相关[10]。目前，已鉴定出多个黏附因子，主要有：P97蛋白、P102蛋白、P116蛋白、P216蛋白、P146蛋白、P159蛋白、Mhp107蛋白、Mhp271蛋白等，这些黏附因子除P159蛋白外，都属于P97/9102双基因操纵子家族。

1.1 P97蛋白

P97蛋白是发现最早、研究最多的Mhp表面黏附因子，含有R1和R2两个重复区域。R1区具有Mhp表面纤毛结合位点和主要抗原识别位点，它既可以作为主要抗原决定簇使机体产生强烈免疫反应也可以发挥纤毛的黏附功能，R2区不能黏附于支气管纤毛表面，可能与黏附宿主上皮细胞外的机制相关[11]。R1区含有9个以上的AAKPV/E串联基序，不同Mhp菌株R1区AAKPV/E的重复数量不同，232株有15个重复，168株有11个重复，J株有9个重复，7448株有10个重复[12]。

P97黏附因子作为一种免疫显性抗原，引发的免疫反应远远早于其他抗原，Feng等[13]以P97 R1原核表达产物作为包被抗原建立SIgA3ELISA检测方法，以鼻试子为检测样本，以做出Mhp的早期诊断，该检测方法的敏感性、特异性和准确性均高于94%，并且该检测方法能够从接种猪肺炎支原体疫苗猪中区分出自然感染猪，所以P97蛋白在MPS早期诊断方面具有非常重要的研究价值。

由于P97抗体在体外能够阻止病原对呼吸道上皮细胞的黏附作用，所以P97黏附蛋白是用于开发亚单位疫苗较好的候选抗原。Barate等[14]通过原核表达并纯化R1重组蛋白(rR1)、R1R2重组蛋白(rR1R2)及大肠杆菌不耐热毒素B单位融合蛋白(rLTBR1、rLTBR1R2)后，分别加入IMS 1113佐剂制成亚单位疫苗后免疫雌性BALB/c小鼠，结果表明每个重组蛋白均能诱导小鼠机体产生针对R1的特异性体液免疫和黏膜免疫应答，其中rLTBR1R2融合蛋白诱导产生的体液免疫应答最快；通过检测血清和支气管肺泡灌洗发现每个重组蛋白均能诱导Th1细胞和Th2细胞反应，并且重要的是针对R1特异性的Th2细胞反应与自然感染和疫苗免疫相似。Okamba等[15]等构建P97 C端重组腺病毒载体疫苗(rAdP97c)，在猪上应用发现能够诱发猪机体产生强烈的P97特异性体液免疫和细胞免疫反应，并且能够降低攻毒试验后肺损伤程度；未免疫组肺损伤程度高达(45.8±11.5)%，而免疫组的肺损伤能够降低至(18.5±9.6)%；其次rAdP97c疫苗能够显著降低炎症反应的程度和减少猪呼吸道Mhp的数量，并且能够提高猪日增重；未免疫组日增重(0.568±0.104)kg，而免疫组能够达到(0.672±0.068)kg。但是与商品化疫苗相比，仅rAdP97c疫苗引起的免疫应答还不够完善，这表明其实具有免疫保护作用的抗原远非P97黏附因子一个，所以在新型疫苗的研究上其他能够引起免疫应答的保护性抗原还有待更深一步研究与开发。王凯等[16]构建的P97重组腺病毒Ad3P97具有良好的免疫原性，也能诱导仔猪产生特异性抗体，但未对免疫剂量、免疫时间及免疫保护期进行研究。

1.2 P102

猪肺炎支原体P102蛋白由Mhp182基因编码，大小约102 kDa，由蛋白酶解加工成位于表面但功能未知的N端(P60，60 kDa)和C端(P42，42 kDa)。Mhp182与编码P97蛋白的Mhp183基因共用一个操纵子，P102蛋白可能具有潜在的吸附纤毛能力或辅助P97蛋白黏附的作用[17]。

Seymour等[18]发现P102重组蛋白(rP102)在生理学上能结合血纤维蛋白溶酶原，增加由组织纤溶酶原激活物(tissue-specific plasminogen activator，tPA)激活血纤维蛋白溶酶的敏感性，P60重组蛋白(rP60)和P42重组蛋白(rP42)在生理学显著水平上也能有效的结合血纤维蛋白溶酶原。Mhp表面结合的血纤维蛋白溶酶原由tPA激活变为血纤维蛋白溶酶后才能够降解纤维蛋白原，Mhp感染猪的呼吸道纤毛上能够检测到血纤维蛋白溶酶原，在支气管肺泡灌洗液中能够检测到较高水平的血纤维蛋白溶酶，研究还发现rP102能够促进黏附猪肾脏上皮样细胞。

1.3 P116

P116蛋白由Mhp108基因编码，是P102蛋白横向同源物，蛋白质组学分析发现P116蛋白可以表达全长，也可以表达17～70 kDa不同大小的片段，当去除P116蛋白C端结构域时P116蛋白将失去结合血纤维蛋白溶酶原的能力，这表明P116蛋白C端是血纤维蛋白溶酶原结合位点，另外P116蛋白片段能够黏附PK15细胞和猪呼吸道纤毛，研究表明P116蛋白是Mhp一个重要的黏附因子和致病相关的毒力因子[19]。

1.4 P216

P216蛋白也是一种猪肺炎支原体高度表达的纤毛黏附因子，由Mhp493基因编码，蛋白序列相对保守，在J株、232株、7448株和168株的同源性达97%，P216蛋白是P97蛋白的一个同源类似物，能够裂解成位于菌体表面的P120蛋白(N端，120 kDa)和P85蛋白(C端，85 kDa)，具有结合肝磷脂和黏附PK15细胞的能力[20]。杜海霞等[21]原核表达P216重组蛋白能与Mhp阳性血清发生特异性反应，间接免疫荧光试验表明该重组蛋白对Mhp黏附猪肺上皮细胞(SJPL)产生占位抑制作用。

1.5 P146

P146蛋白由Mhp684基因编码，包含1317个氨基酸，其中N端的400个氨基酸残基序列与P97黏附因子相同，其他基序特异。P146蛋白在多重位点被不同加工效率的内切蛋白水解成至少9个菌体表面蛋白片段，产生多样性的组合，通过表达其中3个片段(P50、P40和P85)重组蛋白发现均能与免疫Suvaxyn猪支原体肺炎疫苗和感染Hillcrest猪肺炎支原体强毒株6周后的血清发生强烈反应[22]。

1.6 P159

P159黏附因子由Mhp494基因编码，是发现的第一个不属于P97/P102横向同源物家族的黏附因子，在233F↓Q234 和981F↓Q982位点裂解产生27 kDa(P27)、110 kDa(P110)和52 kDa(P52)三段不同大小蛋白[23]。刘茂军等[24]原核表达P159基因片段(3＇端)重组蛋白能够与Mhp阳性血清发生特异性反应，表明该蛋白具有良好的免疫反应原性；表达的截短蛋白与Mhp的黏附试验结果表明，该重组蛋白可以黏附于猪肺上皮细胞(SJPL)表面，并能部分抑制Mhp对SJPL的黏附作用。

1.7 Mhp107

Seymour L M等[25]报道Mhp107蛋白是P97蛋白的横向同源物，是猪肺炎支原体多功能黏附因子家族的一员，对致病机理的研究具有重要意义，为了了解Mhp 107蛋白的功能，分别根据N端、中间结构域和C端设计F1Mhp107、F2Mhp107和F3Mhp107重组蛋白，研究表明F1Mhp107重组蛋白能够结合猪肝磷脂和血纤维蛋白溶酶原，F3Mhp107重组蛋白能够结合纤连蛋白和吸附PK15细胞，三段蛋白均能吸附猪呼吸道纤毛。

1.8 Mhp271

Mhp271蛋白是P97蛋白旁系同源物，是另外唯一一个也包含R1和R2重复序列的黏附蛋白，Mhp271蛋白重复序列包含一组3个重复五肽(R1A271)，2个重复十肽(R2271)和另一组6个重复五肽(R1B271)，为了研究它们的功能，Deutscher等[26]分别构建R1A271重组蛋白(F1271)和R22713R1B271重组蛋白(F2271)，结果发现F2271重组蛋白能够结合肝磷脂、纤连蛋白、猪呼吸道纤毛，而F1271却不能，这表明Mhp271蛋白R1和R2必须同时存在才具有黏附功能。

1.9 Mhp384/Mhp385

Deutscher等[27]发现P102旁系同源蛋白Mhp384在S/T-X-F↓X-D/E位点被有效的裂解成P60384和P50384两段，P97旁系同源蛋白Mhp385由115 kDa、88 kDa和27 kDa大小的3段蛋白片段组成，Mhp384和Mhp385 蛋白的各片段均位于胞外，除了P27蛋白片段均能结合肝磷脂和纤毛。

目前研究发现的Mhp黏附因子中，除P159蛋白外都属于P97/P102双基因操纵子家族。其中P97是目前研究较多黏附因子，在Mhp致病机理研究、诊断试剂盒的研制和亚单位疫苗的开发具有很重要的意义。其他黏附因子在蛋白结构和黏附活性上研究较多，对揭示Mhp的致病机理提供参考依据，但抗原性研究有待进一步验证，从而筛选出更多可供选择的抗原性蛋白。

2 膜蛋白

猪肺炎支原体结构简单，缺乏细胞壁，仅有3种细胞器：细胞膜、核糖体和原核细胞核[9]。菌体的膜蛋白是产生免疫反应的主要免疫原之一，膜蛋白一般包括糖蛋白、脂蛋白和热休克蛋白。其中脂蛋白一般具有较强的抗原性，通常作为Mhp诊断检测的目标。热休克蛋白(heat shock proteins，HSP)是生物细胞在受到热、生物应激、理化因素等应激原刺激发生热休克反应后所产生的一类最保守并由热休克基因所编码的伴侶细胞蛋白[28]。目前猪肺炎支原体只有其中一小部分膜蛋白被仔细研究。

2.1 P46

P46基因的开放阅读框全长1 257 bp，编码419个氨基酸，并含有3个由TGA编码的色氨酸密码子，而且均位于亲水区。P46基因种属内相对保守，可作为猪肺炎支原体分子生物学检测的目的基因。李莹莹等[29]所获得的4株Mhp毒株的P46基因序列与所参考的Mhp J株、232株、7448株及168株的核苷酸同源性为98.4%～99.4%，氨基酸同源性为98.6%～99.5%。陈玉燕等[30]建立的四种猪呼吸道疾病综合征病原多重PCR检测方法和保雨等[31]建立的猪六种重要病原寡核苷酸芯片检测方法中，Mhp的引物和探针均根据P46基因设计。

P46蛋白作为Mhp的表面抗原，具有种特异性，是引起早期免疫反应的表面脂蛋白，也是Mhp的主要免疫优势蛋白，且与其他支原体无交叉反应，可作为血清学的检测的候选蛋白。中国兽医药品监察所以P46为包被抗原研制出了猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒。杜改梅等[32]以P46重组蛋白为抗原进行血清抗体检测发现，免疫后30 d可检测到较高的抗体水平。沈青春等[33]克隆猪肺炎支原体P46膜蛋白亲水区基因，通过原核表达获得重组蛋白能与猪肺炎支原体高免血清反应，具有很好的反应原性和特异性，并使用纯化的重组蛋白作为间接ELISA包被抗原用于检测猪血清中猪肺炎支原体抗体，与现有ELISA检测方法相比具有较高的符合率。

2.2 P65

P65是Mhp膜表面脂蛋白，免疫原结构域位于C端且在细胞膜外侧，N端与脂肪分解酶相似，具有酯酶活性并能分解脂肪酸[34]。P65蛋白主要通过破坏宿主肺泡细胞的表面张力来降低宿主细胞的稳定性，导致肺脏功能性障碍[35]。P65蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白之一，与其他支原体无交叉反应，在猪支原体肺炎发病过程中能够被特异性识别，常应用于Mhp血清学检测和亚单位疫苗的开发。

刘思远等[36]为研究猪肺炎支原体168弱毒株重组蛋白P65的免疫原性，构建原核表达载体pET-28a-P65，经诱导表达、纯化获得的重组蛋白与佐剂乳化后免疫注射小鼠，通过ELISA测定小鼠血清的抗体效价为1∶12 800；选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验，保护率可达80%，表明重组蛋白P65具有良好的免疫原性。刘茂军等[37]通过基因合成获得P65基因中含有3个稀有密码子的前922 bp，利用PCR从猪肺炎支原体l68株扩增获得P65基因后段，然后通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将前后段连接后，构建重组质粒进行诱导表达，获得的重组融合蛋白能够与Mhp血清呈强阳性反应并具有良好的免疫原性。另外，应用该重组蛋白免疫小鼠，用Mhp全菌蛋白和P65蛋白筛选，制备了1株特异、稳定单克隆抗体3G12，该株单克隆抗体可与P65蛋白和Mhp全菌蛋白反应，采用间接ELISA法测得3G12细胞培养上清与P65蛋白反应抗体的效价为1∶12 800，与全菌蛋白反应抗体的效价为1∶3 200；3G12腹水与P65蛋白反应的抗体效价为1∶4 000 000以上，与168 全菌蛋白反应的抗体效价为1∶20 000以上[38]。之后，使用原核表达的P65蛋白及制备的P65蛋白单克隆抗体建立阻断ELISA检测方法，该方法的特异性和敏感性与IDEXX商品化的ELISA诊断试剂盒相似，是一种可使用的猪肺炎支原体血清学检测方法[39]。

2.3 Mhp366蛋白

Meens等[40]通过分析猪肺炎支原体232株基因组编码的35种预测脂蛋白，筛选出105个可能的B细胞线性表位，免疫印迹发现Mhp366蛋白的一个表位能够与康复猪血清有强烈的特异性免疫活性反应，却不能够与接种疫苗的猪血清发生反应。遂以表达、纯化的GST-Mhp366融合蛋白作为包被抗原，建立ELISA检测方法，以80份猪血清为检测样本，同时与2种商品试剂盒：间接ELISA试剂盒(IDEXX HerdChek Mycoplasma hyopneumoniae1)和阻断ELISA试剂盒(Oxoid Mycoplasma hyopneumoniae ELISA)的检测结果作对照，并结合Western-blot试验结果发现该蛋白不能检测到疫苗免疫猪血清中的Mhp抗体而能检测到康复猪血清中的抗体，Mhp366蛋白是发现的第一个能区分疫苗和野毒感染抗体的蛋白，研究意义重大。

2.4 DnaK蛋白

DnaK蛋白又称为HSP70，是一种重要的热休克蛋白，具有免疫优势抗原的特性，可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫的发生，其N端的主要作用在于分子伴侣作用，而C端主要表现为免疫原和免疫佐剂的作用。李媛等[41]通过基因序列比对发现，DnaK基因在Mhp种内高度保守，种间差异较大，通过原核表达DnaK C端重组蛋白可以与猪肺炎支原体阳性血清发生反应，具有良好的免疫活性。刘茂军等[42]应用DnaK重组蛋白包被板对所测样品的检测结果与IDEXX检测结果相比，有很大的非特异性显色，但是免疫后30 d到45 d抗体产生趋势是一致的。

3 胞内蛋白P36

P36蛋白又称乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase，LDH)，是Mhp的一种特异性免疫优势蛋白。P36基因在Mhp进化过程中高度保守，具有细菌LDH的典型区域，并且同源性很高。近几年，国内对猪支原体P36基因的研究主要集中在猪支原体检测方法的建立和蛋白的表达方面。因猪肺炎支原体P36基因保守且特异性高，以P36基因为目的基因建立的检测方法很多，例如PCR[43]、巢式PCR[44]、环介导恒温扩增技术[45]、斑点杂交[46]、显色原位杂交[47]等检测方法。

猪肺炎支原体P36蛋白具有L-乳酸脱氢酶(LDH)活性，具有种属特异性的抗原决定簇，可作为血清学检测的候选抗原。胡茂志等[48]通过原核表达P36蛋白，利用淋巴细胞杂交瘤技术，获得了针对Mhp P36蛋白的单克隆抗体，为Mhp种特异性检测方法的建立奠定了基础。祝永琴等真核表达获得分泌性P36蛋白，而且具有良好的反应原性[49]，并使用酵母表达的P36蛋白作为包被抗原包被酶标板，用羊抗猪IgG-HRP作为酶标二抗，建立了稳定的抗猪肺炎支原体IgG间接ELISA检测方法[50]。

4 展 望

猪肺炎支原体是一种慢性接触性传染病，本身致死率不高，但继发性感染死亡严重，每年对我国养猪业造成严重经济损失。初步统计，该病在我国阳性感染率约70%～90%，发病率达40%以上[51]。饲养管理和卫生条件是影响本病发病率和死亡率的重要因素，缺乏维生素及矿物质或品质不良，骤然更换饲料或饲料单纯，猪舍潮湿和拥挤、通风采光差、猪群缺乏运动等也影响较大。Mhp主要定植于猪气管及支气管中，损坏气管、支气管的纤毛上皮细胞和呼吸道黏膜层，还可以抑制机体免疫应答，破坏巨噬细胞的功能，极易发生继发感染和混合感染。

预防猪支原体肺炎除加强饲养管理外，疫苗免疫也是必不可少的措施，目前商品化疫苗产品主要为进口灭活疫苗和国产弱毒疫苗。国外灭活疫苗价格昂贵，使猪场生产成本增加，而且灭活疫苗以体液免疫为主，保护作用有限。中国兽药监察所最初研制的Mhp乳兔化弱毒RM48株长期在乳兔体内传代，无法适应工厂化条件下规模化疫苗生产，之后开展培养基疫苗的研究，通过使用不同的培养基反复多次诱导传代，使该菌株逐渐适应了培养基生长，该疫苗可诱导机体产生良好的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫，免疫效果确实；另外，该疫苗既可以胸腔注射免疫也可以喷雾或滴鼻免疫，使用方便。江苏农业科学院畜牧兽医研究所研制育成的168株无细胞培养弱毒苗，攻毒保护率达80%左右。以上两株弱毒疫苗打破了国内对进口灭活疫苗的限制，已成为大面积推广使用、具有较高免疫保护率的猪支原体活疫苗。

近年来，随着对Mhp分子生物学研究的发展，越来越多的功能蛋白被发现报道，使Mhp致病机理的研究、血清学诊断和亚单位疫苗的开放等方面有了很大的进步。Mhp黏附因子具有结合猪呼吸道纤毛、肝磷脂、纤连蛋白和血纤维蛋白溶酶原等功能，在猪肺炎支原体致病过程中发挥重要作用，但目前研究还局限在蛋白结构和功能方面，其免疫特性还有待进一步开发。菌体的膜蛋白是产生免疫反应的主要抗原之一，通常作为Mhp分子生物学和血清学检测的目标。在新型疫苗研发方面，专家学者们一直在对比和寻找抗原性强、保护率高的蛋白。虽然猪肺炎支原体新型疫苗的研究很多，但是单一的基因或蛋白组分疫苗的保护率还有待进一步验证，这还需要专家学者们进一步寻找更加有效的抗原蛋白并考虑多价苗的免疫效果。

蛋白是生命活动的主要承担者，不同的蛋白在Mhp致病过程中发挥不同的作用，所以研究与应用的侧重点也不同。本研究综述Mhp主要黏附因子、膜蛋白及细胞质蛋白等主要保护性抗原蛋白的研究进展，旨为该病原致病机理研究、特异性诊断方法的建立和新型疫苗的研发提供一定的理论基础，对MPS的正确诊断、预防和控制具有重要意义。

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