影响牛体外胚胎生产效率的因素

王 娜 ，李 姣 ，王小武 ，郭 晶 ，赵明礼 ，郝少强 ，郭春明 ，马 毅

（1.天津中科博雅生物育种研究有限公司 300457；2.全国畜牧总站 100125；3.天津市畜牧兽医研究所 300384）

在牛繁殖领域，大量进行体外胚胎生产已有近30年的历史，但这主要作为研究手段，一方面用来了解体内胚胎正常发育的过程，另一方面作为其他生物技术（如转基因、克隆等）的研究材料[1]。然而近年来，牛体外胚胎生产技术越来越得到众多科研人员的重视，也取得了显著性的研究成果。国外一些发达国家已成功将该技术应用于牛生产实践，而我国仍停留在实验室研究阶段，尽管有将体外受精胚胎进行移植并顺利妊娠产下犊牛的报道，但仍处于初期探索阶段[2]。因此，为加快我国牛良种繁育进程和摆脱人们日益对进口牛类畜产品的依赖，现阶段亟需将该技术与胚胎移植、活体采卵（OPU）技术相结合，应用于生产实践，推广应用。

与体内胚胎相比，体外胚胎移植后的妊娠率显著低于体内胚胎移植后的结果，其根源在于体外胚胎移植后建立和维持妊娠的能力，这也是限制体外胚胎用于生产实践的关键因素[3-4]。牛体外胚胎生产主要由卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精、胚胎体外培养等三个关键步骤组成，这三个步骤的顺利进行与胚胎移植后的存活及成功妊娠密切相关。因此，本文总结了上述三个环节中影响胚胎产量和质量的因素，以期为后续体外胚胎生产技术的优化研究和推广应用提供参考。

1 卵母细胞体外成熟

1.1 卵母细胞来源

胚胎的大部分遗传物质来源于卵母细胞，因此，卵母细胞的发育潜力直接影响体外受精和囊胚形成效率，所以，在一定程度上胚胎的发育潜力在受精时就已经被决定了[3]。卵母细胞发育潜力也称卵母细胞质量，研究表明，卵母细胞来源对卵母细胞质量有显著影响，不同来源的卵母细胞，其质量差别也较大[1]。未成熟卵母细胞的来源主要有两种途径，一是从屠宰场卵巢中获取，利用切割或抽吸法获取卵巢表面2～8mm卵泡内的卵丘—卵母细胞复合体（COCs）进行体外成熟[5]。该方法取材容易、成本低，但很难确定卵母细胞的系谱，常用于体外胚胎生产技术体系的优化研究。二是OPU，即借助B超引导、真空泵抽吸的方式，通过阴道穹隆进行卵巢穿刺采卵。该方法需要一定的操作技巧，对技术人员的要求较高。操作过程中若真空泵压力过大，会导致卵丘细胞丢失，裸卵率较高；压力过小则不易抽出卵母细胞，影响回收效率。因此，需要不断调整真空泵的压力，以获取数量多且质量好的COCs。而目前的研究结果显示，屠宰场卵巢获得的COCs体外成熟效果要优于OPU来源的COCs[6]。这一结果可能与获取卵母细胞时的卵泡大小和卵丘细胞特征有关，因为卵泡大小和卵丘细胞特征是影响卵母细胞质量的重要因素[4]。但现阶段在不损伤卵母细胞的情况下，通过卵泡大小和卵丘细胞特征来评估COCs后续发育能力的标准尚未建立，仍需更多更深入的研究。

1.2 体外成熟条件

卵泡内的微环境和母体之间通过信号传递来支持卵母细胞生长并使其逐渐获得发育能力，两者之间的双向通信极其复杂，需要多个信号通路的协同作用，这种高度的复杂性使得辨别卵母细胞后续的受精和发育能力异常困难[7]。但研究证实卵母细胞一旦从卵泡中脱除，其发育潜力就会受到限制，发育的最大潜力也就被固定了[1]。因此，研究人员通过在基础培养液（TCM199）中添加激素、血清、生长因子、抗氧化剂等物质，结合培养箱特定的环境条件，尽量模拟体内成熟环境，以达到最佳的体外成熟效果。

1.2.1 激素

促卵泡素（FSH）和促黄体素（LH）是IVM体系中最常见的激素添加剂。补充FSH和LH可以诱导卵丘细胞扩散、细胞核和细胞质成熟[8]。除此，类固醇激素LH在哺乳动物卵母细胞成熟过程中对减数分裂的恢复有重要作用[9]。尽管有研究表明牛COCs的卵丘细胞能够在培养体系中分泌雌二醇（E2）和孕酮（P4）[10]，但是牛COCs的IVM体系通常采用微滴培养，即在矿物油覆盖的培养介质中进行成熟，由于油的高吸收能力，介质中E2和P4的浓度会降低，从而影响COCs的成熟效果[11]。因此，IVM液中也常添加E2以促进COCs体外成熟，但添加P4的研究较少。

1.2.2 气体环境

O2对于卵母细胞顺利成熟非常重要，但O2水平较高会不利于卵母细胞成熟如活性氧（ROS）的产生，会损伤卵母细胞[12]。生理条件下卵泡液中的O2浓度在3%～13%之间，而大多数牛的IVM方案中使用20%的O2浓度，这相当于空气中的O2浓度。因此，卵母细胞体外培养的气体环境与体内条件差别很大。但也有研究报道，牛IVM期间用5%O2浓度不利于卵母细胞的成熟[13]。因此，现阶段关于牛卵母细胞IVM过程中气体环境影响的研究，尚未就卵母细胞成熟的最佳O2浓度得出一致的结论，需进一步研究探索。

1.2.3 抗氧化剂

ROS是配子和胚胎代谢过程中产生的生理副产物，是一种强大的氧化剂，低浓度的ROS在体内发挥着重要的生理作用，如促进卵母细胞的发育和调节植入前胚胎发育的速率等，然而，ROS浓度过高可诱导细胞内成分的氧化损伤和细胞凋亡，进而对细胞功能产生有害影响[14]。

由于ROS存在会对卵母细胞成熟产生不利影响，许多研究通过向培养液中添加抗氧化物质来消除ROS的影响，如褪黑素[15-16]、番茄红素[17]、半胱氨酸[18]、白藜芦醇[19]等，能够有效地降低牛卵母细胞中ROS含量，提高成熟效果。但也有报道称这些物质在提高胚胎发育能力方面差异不显著[19]，而具体何种抗氧化物质在提高胚胎生产效率方面有突出的效果还未见报道。

1.2.4 血清、生长因子、糖类物质等

研究表明，在体外成熟液中添加10%的胎牛血清（FBS），有助于卵母细胞成熟及防止透明带硬化[20]。目前FBS已成为IVM体系中的常规添加物之一，但进口FBS管控严格、价格昂贵，且FBS中未经鉴定的激素可能会影响培养基批次的一致性，因此，研究人员转向探索无血清的替代培养液，用牛血清纯化得到的白蛋白（BSA）作为替代，现已有商业化的无血清成熟培养基（如日本FHK公司的IVMD101，英国IVF Bioscience公司的BOIVM）被开发出来。

向IVM培养液中添加表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）等能促进牛卵母细胞成熟、卵丘细胞扩展[21]。

IVM期间充足的葡萄糖供应是卵母细胞代谢的基本要求。在培养基中添加葡萄糖可促进牛卵母细胞减数分裂的恢复，但IVM期间高浓度的葡萄糖又不利于随后的胚胎发育，研究发现这是由于细胞内ROS升高引起的[22]。当IVM期间使用较低的O2浓度培养，同时使用补充葡萄糖的成熟培养基会提高最终的囊胚率[23]。因此，葡萄糖可能与O2代谢密切相关，适量的葡萄糖补充与合适的O2浓度协同作用才能有助于胚胎发育。

2 体外受精

2.1 精子来源

通常成熟后的卵母细胞要与处理好的精子在体外条件下共孵育若干小时，才能完成体外受精过程，形成的合子中有一半的核物质来源于精子。报道称精子为胚胎发育贡献了用于第一次卵裂的中心粒和一些mRNA[24]，精子功能失调引起的受精延迟可能是导致卵母细胞老化和胚胎发育缺陷的重要因素[3]。许多研究也表明不同的种公牛，其精子的体外受精能力存在显著差异[25-26]，可见精子来源也是限制体外胚胎生产效率的重要因素，因此，在以后的生产实践中就需要挑选优秀的种公牛精液进行体外胚胎的生产。

2.2 体外受精液

目前研究中常用的受精体系有两种，BO液和TALP液，国外也已有商业化的试剂（如美国MOFA公司的IVF培养基，英国IVF Bioscience公司的BO-IVF培养基）正在推广使用。牛冻精经37℃水浴解冻后，需先用洗涤液处理，目前通用的处理方法是两次离心法，但不同的受精体系，精液处理时所用离心力有所不同，离心力过高会损伤精子，过低会影响精子的分离效果。BO液和TALP液需要1500r/min，每次5min[27]；而商业化试剂的受精体系需要328g或400g，离心时间也不尽相同。因为离心机的转速与离心力之间的换算关系与所用离心机的半径有关，所以无法就研究中使用的转速与商品试剂中的离心力相比较，因此，以后的研究中也建议明确精子处理的离心力，以便于后续类似的研究优化改进。

在体内条件下，精子获能是精子在受精前必须经历的一个重要阶段，只有经过获能的精子才具有受精能力，因而，在体外也同样需要此步骤[28]。牛精子体外获能的方法主要是化学药物诱导，向受精液中加入肝素或钙离子载体，其中肝素对精子有害影响小，较为常用[29]。BO液处理精子时还加入了咖啡因，使得精子获能更快，增强了其获能效果[6,27]。

不同的受精体系，受精时间不同，BO液一般为6～8h，TALP液一般为18～24h[30]。但无论何种受精体系，最终受精时调整后的精子浓度基本都为100万～200万个/mL。

在体外受精环节研究中，成熟后的卵母细胞一般要去除部分卵丘细胞，再与精子在受精液中共孵育[31]，而商品化培养液则一般要求保留卵丘细胞，尽量不要扰动扩散的卵丘细胞团块。因此，在去除部分卵丘细胞以及对后续胚胎发育影响等方面值得去深入研究，得出更准确的结论。

3 体外胚胎培养

3.1 胚胎培养液

目前常用的牛体外胚胎培养液主要有CR1aa和SOF液两种，这类培养体系要求培养过程中需不断补充添加血清的新鲜培养液，直至第7d发育至囊胚阶段。而商品化的培养液（如美国MOFA公司的IVC培养基，英国IVF Bioscience公司的BO-IVC培养基）则7d内无需补充新鲜培养液，大大方便了后期培养。但也有研究表明自配液与商品液的体外胚胎生产效率无显著差别，但自配液成本要远低于商品液，因此更倾向于自配体系的推广使用[32]。

3.2 共培养

在哺乳动物中，胚胎早期发育是影响成功妊娠的最关键步骤之一，这主要发生在母体输卵管内，母体输卵管为配子受精前的准备、运输、存活、受精和早期胚胎发育提供了最佳环境，胚胎—母体之间的有效联系对早期胚胎的成功发育和存活是必需的[33]。因此，为了更好的模拟体内环境，研究者尝试在牛体外胚胎培养液中加入一些细胞，使之与早期胚胎共培养，目前已经在自源、异源卵丘细胞[34]、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）和输卵管上皮细胞[35]、马骨髓间充质干细胞和马羊膜上皮干细胞[36]等方面进行了研究，结果可不同程度地提高体外胚胎发育效率和质量。但在操作过程中需要严格控制加入共培养细胞的浓度，浓度过高，会过多消耗培养液中的营养成分，产生较多的有害代谢产物，对胚胎发育产生不利影响。

3.3 培养环境

有研究表明胚胎在培养过程中暴露的环境可能会影响它们的质量和活力[37]。同牛的IVM方案中一样，牛体外胚胎培养体系也都使用20%的O2浓度，而高O2浓度培养会导致ROS的产生增加，损伤细胞的线粒体功能，导致胚胎死亡，因而，培养过程中使用的O2浓度是牛体外胚胎产量的重要决定因素[3]。为此，许多研究者在胚胎培养液中添加抗氧化剂，以阻止ROS对胚胎的损伤，结果可显著提高胚胎的质量和产量[38]。但也有研究指出在胚胎培养过程中可以使用低氧培养系统，当O2浓度从20%降至5%时，可观察到胚胎发育率明显增加[37]。而最近的研究表明低氧培养系统适用于无共培养细胞存在的情况下，共培养条件下仍需用20%的高O2培养系统[35,39]。因此，体外胚胎培养需要根据使用共培养细胞与否选择不同的培养条件。

4 展望

综上所述，影响牛体外胚胎生产效率的因素有很多，不能过于看重某一方面的因素，需要从体外培养液的成分和培养环境的整体效应来分析。我国的牛体外胚胎生产技术，虽然实验研究上已接近发达国家的水平，不同实验室都建立有各自的牛体外胚胎生产体系，但在生产实践上却不及一些发达国家。因此，以后的研究在注重提高体外胚胎生产效率的同时，更应注重提高体外胚胎移植后的发育潜力。研究人员可以和胚胎移植实践者之间建立合作关系，进行胚胎移植试验，以获得更有意义的结论；或可以利用分子生物学和组学知识来确定体内、外胚胎在生物学特征方面的差异，以预测体外胚胎移植后存活的可能性。相信在不久的将来，研究者会很快开发出更优化的牛体外胚胎生产体系，应用于生产实践，加快我国牛良种扩繁的进程。