乌梢蛇鉴别技术研究

梁新合，王 会，金 平，张 辉，孙佳明

（长春中医药大学，长春 130117）

乌梢蛇为游蛇科乌梢蛇（Zaocys dhumnades）的干燥全体，无毒，别名乌风蛇、乌蛇、青蛇、黑乌梢等。乌梢蛇性味甘、平，归肝经，具有祛风、活络、止惊的功效；临床上用于风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼喁斜，抽搐痉挛，破伤风，麻风，疥癣等疾病的治疗[1]。但是由于大量的猎杀捕捉，造成了中药资源的严重短缺，其价格也显著上涨，从而引起一些不良商贩利用其他廉价蛇种进行伪造，对国内乌梢蛇药材市场产生很大影响，所以鉴别技术的发展及改进有待进行。因此新技术如PCR法、DNA快速提取法、电泳法等开发与利用已经成为热门课题，得到高度的重视。

1 传统的鉴别技术

1.1 形状鉴别 乌梢蛇，为游蛇科动物乌梢蛇除去内脏的全体，生存于海拔1600 m以下的中低山地带，常在农田、河沟附近出现。其体形较大，无毒，蛇体全长2.5 m以上，一般雌蛇较短，眼睛较大，鼻孔大而椭圆，位于两鼻鳞之间；上唇鳞有8枚，其4、5枚入眼，下唇鳞9～11枚，第6枚最大；颊鳞低矮，1枚，眼前鳞1枚，上缘包至头背，颞鳞前后各2枚；背鳞前段16行，后段14行，背脊中央2～4行起棱；腹鳞186～205枚，尾下鳞105～ 128枚，肛鳞2枚；体呈青灰褐色，各鳞片的边缘呈黑褐色；背中央的2行鳞片呈黄色或黄褐色，其外侧的2行鳞片则成黑色；上唇及喉部淡黄色，腹面灰白色，其后半部呈青灰色。此法不适用于烘干、熏蒸、切片等处理的中药材鉴别[2]。

1.2 显微鉴别 其方法是采用电子扫描显微镜观察，如果出现乌梢蛇背脊鳞增厚并表面有棱脊，纹饰呈横向渡状排列且为弯曲不直的条带纹，条带纹同向排列紧密，还有如滴水状的刺尖端的特征，即为真品，反之无此特征者即为伪品。杨小平等[3]通过光学显微及扫描电镜鉴别对乌梢蛇及其伪品玉斑锦蛇、灰鼠蛇、水赤链游蛇的鳞进行了研究，结果表明伪品蛇鳞片的特征与真品虽有相似处，但形状、颜色、纹理的细微结构在扫描电镜下有显著差异，纹饰的结构可为真伪乌梢蛇鉴别的提供可靠的依据。此方法适用于样品为碎段或无正品对照时，为鉴别提供参考依据。

1.3 色谱法鉴别 熊学敏等[4]采用薄层色谱法对纯蛇粉胶囊中的主要成分乌梢蛇进行定性鉴别，其操作简便，稳定性好也可重复操作，可作为鉴别该胶囊有效成分的方法；该方法采用了中药小白花蛇、地龙、蕲蛇和空白对照反复比较，均未检出可鉴别该胶囊主成分乌梢蛇的色谱斑点，因此，该方法具有定性检验的鉴别意义以及为质量控制提供依据。但方法也有局限性，其表现在当无对照品时，难以鉴别。黄文琦课题组通过以乌梢蛇主成分氨基酸为标准，应用HPLC建立16个共有特征吸收峰的指纹图谱[5]。此方法为部分掺假的伪药提供准确的鉴别依据。此外，有研究通过对乌梢蛇及红点锦蛇石油醚浸出物紫外最大波长检测，结果发现两者最大吸收波长接近，但结合紫外光谱图来看，两者具有显著差别，并且该结果稳定，重现性好。

2 现代鉴定技术

2.1 基于PCR技术，开发一系列高效、准确的分子水平的鉴别方法 由于传统的鉴别技术性状、显微、色谱法以及经典的PCR[6]技术鉴别项还不够完善，难以准确的鉴别乌梢蛇的真伪。为了获得一种快速、准确、有效的鉴别蛇类真伪的方法，陈康等[7]通过对经典 PCR技术方法条件进行优化，并且结合 DNA快速提取技术[8-9]和荧光检测技术[10-11]将药典中蛇类（乌梢蛇、金钱花白蛇、蕲蛇等）鉴别时间缩短为30 min左右，大大加快了中药材的鉴别效率，同时也为真伪鉴定试剂盒的开发奠定基础。在临床检验和司法检中也将产生重大影响[12-14]。考虑到PCR方法中提取乌梢蛇 DNA要求准确、简便，且影响鉴别因素诸多，引起专家、学者们的研究热情，如唐晓晶等[15]通过选取乌梢蛇及其他10种常见混淆品，利用它们线粒体中的12 srRNA基因序列，设计一对专属于乌梢蛇鉴别的引物 HWL-1和 HWH-1，其原理是利用不同复性温度进行PCR扩增，从而得到相应特异性反应条带，有且只有正品有良好的反应条带。因此利用此方法对市场上购买的各种混淆品进行鉴别。结果表明：在65 ℃复性温度下，正品乌梢蛇在约320 bp处出现阳性扩增带，而混淆品在相同的条件下无扩增带。此设计的鉴别引物对正品乌梢蛇具有高度的特异性，对于经过醋炙的乌梢蛇段，已经失去个体的完整性，能很好的克服这个弊端，并且此方法简单、精确、灵敏、效率高、重现性好具有很大的实际应用价值。

此外，孙清萍等[16]鉴于常用的PCR技术需求的条件高、步骤多、时间长难以实现快速检测，为了加快效率，基于环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplifi cation，LAMP）开发一套快速筛查乌梢蛇正品的方法。其过程主要是：通过以乌梢蛇12srRNA基因序列为基础设计并筛选出1套LAMP引物，实现乌梢蛇的LAMP特异性扩增，而其他蛇类没有明显变化。但是其实是在DNA快速提取[17-18]的基础上运用LAMP进行快速筛选这与PCR技术第一步相同，只是后续步骤不一样，而到达高效的要求，实现分子水平对中药材的筛选鉴别。其在有DNA的存留的中药材、食品等筛选鉴别中有显著的应用价值。

李梓僮等[19]应用现代DNA 指纹技术，即通过对2015 年版《中国药典》乌梢蛇DNA检测方法[20]进行了优化和改良，研制了乌梢蛇DNA提取和检测试剂，开发了乌梢蛇 PCR检测试剂盒；该实验用试剂盒法提取的DNA样品，经特异引物PCR扩增后，正品乌梢蛇DNA与引物有特异性结合位点，扩增产物约为 300 ～ 400 bp，伪品均无扩增条带。并与中国食品药品检定研究院用药典方法得到的结果完全一致。此项研发优化了PCR技术的操作步骤，使原本反复的配制试剂过程变得简单，最大程度减少了鉴别者的工作量，缩短了鉴别时间周期，降低了由于实验人员操作造成的DNA污染的可能性更多的可以广泛地应用到药品检验的基层单位。

2.2 基于化学成分分析，高效毛细管电泳技术的应用 另外一种从化学成分角度考虑的鉴别技术就是高效毛细管电泳（HPCE）。对于乌梢蛇化学成分许多学者都有研究，郑艳青等[21]对乌梢蛇化学成分进行了总结，其主要成分中氨基酸包括：天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（ser）等；无机元素：钙、铜、铁、钾、镁等；其他成分：蛋白质、脂肪、果糖-l，6-二磷酸醋酶、蛇肌醛缩酶以及胶原蛋白。

电泳法是目前鉴别中药材特别是动物药的首选方法。李峰等[22]通过采用HPCE技术，对10批选自不同产地的乌梢蛇药材进行指纹图谱研究。通过优化试验条件（参照物的选择、电泳条件选择）使其HPCE图谱在30 min内完全分离。结果发现它们只有 7 个共有峰，即将其作为鉴别乌梢蛇的特征指纹峰。将这10批药材通过与共有模式对比，结果显示其相似度为0.86～0.99，方法学考察符合要求，因此说明该方法具有良好的精密度和分离效果，可作为乌梢蛇药材质量评价的有效方法。但各样品共有峰为哪种成分不能确认。因此，其实验的研究结果只能说明动物药材存在成分及含量不同，不能明确判定各药材商品质量的优劣。肖寄平等[23]采用聚丙烯酰胺凝胶电泳针对一些死亡动物肢体未降解蛋白复合占有比例差别鉴别乌梢蛇与其他蛇类。但需要注意的是蛋白样品提取条件需要较严格。

3 小结

综上所述，随着科技的发展，技术都在更新，以往的乌梢蛇真伪鉴别技术也由传统性状鉴别、鳞被与骨骼鉴别、显微鉴别、理化鉴别发展到经过优化的PCR技术鉴别、高效毛细管电泳技术等，对中药材中出现的一些漏洞进行弥补。2015 年版《中国药典》在测量定项尚无收载，故很难实现对不完全掺伪、掺杂蛇类中药的鉴别。所以还需要重视药用活性成分与药效学的研究，探寻更合适的鉴别和质量控制方法，也期待着一些新技术的开发运用，将逐步引导乌梢蛇的真伪鉴别向高效、准确、稳定的方向发展。

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