乌梢蛇PCR快检试剂盒的应用与评价

杨志业1 方 竑1 谭颖仪1 刘 昂1 赵玉洋 袁 媛

1.广东省药品检验所，广东 广州 510663；2.中国中医科学院中药资源中心，北京 100700

乌梢蛇首载于南北朝《雷公炮炙论》[1-2]，其后历代本草多有记载，尤以明代李时珍《本草纲目》的记载最为详尽，在我国已有几千年的药用历史。历版药典规定乌梢蛇为游蛇科动物乌梢蛇ZaocysdhumnadesCantor 除去内脏的干燥体，具有祛风、通络、止痉的功效。在现代临床上，乌梢蛇广泛用于治疗皮肤瘙痒症、白癜风、牛皮癣等，如乌蛇止痒丸、白癜风丸等[3]。乌梢蛇养殖成本较高，其商品主要为野生。随着野生动物保护力度的进一步加强，乌梢蛇市场资源短缺，价格显著上涨，为了牟取暴利，市场上出现了多种乌梢蛇伪品或混淆品[4]。

传统鉴别方法多以蛇头、腹鳞、体背鳞、肛鳞及尾下鳞的特征作为主要鉴别点[5]，但专业性要求高，而且经去头及鳞片后切制或酒制等炮制加工的饮片，鉴别难度大，无法满足对市售乌梢蛇质量控制的要求。中国药典自2010年版始收载了聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测法对乌梢蛇进行鉴别，该法与传统方法相结合更为准确、可靠[6-9]。但经典PCR法对实验环境、操作人员要求高，常规裂解过程耗时长、步骤多，至少需要3.5 h才能完成单次检验，无法适应当前中药分子鉴定技术现场运用的需要。为了获得一种快速、准确、高效的鉴别乌梢蛇真伪的方法，陈康等[10]通过对经典PCR技术方法条件进行优化，采用碱裂解法提取乌梢蛇基因组DNA[11-12]，提取过程无需使用离心机，采用SYBR Green I荧光检视[13]代替琼脂糖凝胶电泳，无需使用电泳仪及凝胶成像系统等仪器，将乌梢蛇PCR鉴别方法试验时间缩短为30min，并研制为快检试剂盒，为实现中药材分子鉴别的现场运用奠定了基础[14]。

《中国人民共和国药品管理法》第一百条中规定：“对有证据证明可能危害人体健康的药品及其有关材料，药品监督管理部门可以查封、扣押，并在七日内作出行政处理决定”，药品质量快速筛查方法及产品就是为了在监督现场对样品进行快速分析，为药品监管部分及时提供“证据”，使对大众身体或财产具有较大危害性的药品得到提前控制。因此，为更好地开展现场快检快筛，提高市场监督、执法的效率，有必要对快检产品进行评价，为药品监管部门的选择和使用提供依据。笔者通过分析乌梢蛇PCR快检试剂盒的特异性、重复性、稳定性、检测限等性能指标，以及通过与“药典法”对比，通过对136批市售样品的检测，考察试剂盒检测结果的准确率、假阳性率和假阴性率，进而对乌梢蛇PCR快检试剂盒进行综合评价，为同类快检产品的评价提供案例。

1 仪器与试药

1.1 仪器 MM400珠式组织细胞破碎仪(RETSCH)；BIORAD T100 PCR仪(BIORAD)；eppendorf centrifuge5481 离心机(EPPENDORF)；CAMAG REPROSTAR3薄层色谱照相装置(CAMAG)；Sub Cell GT水平电泳系统 (BIORAD)；Molecular Imager Gel DocTM XR+ Imaging System 全自动凝胶成像系统(BIORAD)；DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)。

1.2 试药 乌梢蛇PCR快检试剂盒(北京博奥晶典生物技术有限公司)； Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(Takara公司)；蛋白酶K(Promega 公司)；Takara Ex Taq(Takara公司)；DNA 分子标记(100-1000bp，Takara公司)；中国药典2015年版乌梢蛇药典法引物(Invitrogen公司合成)； Agarose G-10琼脂糖(Biowest)；电泳缓冲液配制试剂EDTA、Tris为分子生物学级试剂，冰醋酸为分析纯。

样品分为2类，一类是对试剂盒的性能进行考察的样品，样品信息见表1，样品均经中国中医科学院中药资源中心金艳教授鉴定；另一类是对试剂盒的应用进行评价的样品，收集于流通领域中的生产企业、药店、医疗机构、药材市场等，包括市售乌梢蛇粉12批(编号为WS-F001～WS-F012)；市售乌梢蛇饮片29批(编号为WS-S001～WS-S029)；市售酒乌梢蛇42批(WS-J001～WS-J042)；乌梢蛇药材样品3批(蛇鲞，编号为WSZ001～WSZ003)；乌梢蛇伪品50批(编号为SL001～SL050)，包括乌梢蛇常见伪品灰鼠蛇、滑鼠蛇、赤链蛇等。

表1 乌梢蛇PCR快检试剂盒性能参数考察用样品信息表

2 方法

2.1 乌梢蛇PCR快检试剂盒性能检测 参考2015年版中国药典三部生物诊断试剂盒的要求，对试剂盒的特异性、检测限、重复性等性能进行考察。

2.1.1 特异性 抽取乌梢蛇药材、乌梢蛇饮片、酒乌梢蛇各2批，灰鼠蛇、滑鼠蛇、铅色水蛇各2批，分别采用试剂盒进行检测。

2.1.2 检测限 取WS1，分别取25 mg、20 mg、15 mg、10 mg、5 mg、4 mg、3 mg、2 mg、1 mg，分别采用试剂盒进行检测。

2.1.3 重复性 抽取乌梢蛇药材、乌梢蛇饮片、酒乌梢蛇各1批，灰鼠蛇、滑鼠蛇、铅色水蛇各1批，在同一实验室相同条件下，由3位实验员采用同批次试剂盒分别进行试验，考察批内重复性。同时由同一位实验员分别采用3个不同批次试剂盒进行检测，考察批间重复性。

2.1.4 稳定性 随机选取一个试剂盒，分别放置至溶解，再分别按保存条件保存，如此反复分别经过 1、5、10次后，对试剂盒内的DNA提取试剂，阴性对照、阳性对照进行检测。

2.2 乌梢蛇PCR快检试剂盒应用评价 实验人员分为2组，第一组采用中国药典2015年版一部乌梢蛇项下收载的PCR法对136批样品进行测定赋值，测定好后进行随机编号，形成盲样；由第二组采用PCR快检试剂盒方法进行测定，独立汇总检测结果。通过比较两个实验室的相应的结果进行分析，结果不一致的进行复测，计算乌梢蛇PCR快检试剂盒的阳性结果准确率、阴性结果准确率、假阴性率、假阳性率等指标。

2.2.1 乌梢蛇聚合酶链式反应(PCR)药典方法 取样品0.5 g，充分研磨使成粉末，取0.1 g，照中国药典2015年版一部乌梢蛇饮片【鉴别】项下操作，简称为“药典法”。

2.2.2 乌梢蛇PCR快检试剂盒方法 乌梢蛇PCR快检试剂盒方法分为A、B两部分，A部分为提取总DNA所用的试剂及耗材，于2～8 ℃保存；B部分为PCR扩增部分所用的试剂及耗材，于-20 ℃下保存，简称“快检试剂盒法”。具体操作如下：①取10～25 mg样品粉末，使用碱裂解法提取总DNA，所提取DNA稀释10倍作为供试品溶液。另分别取阳性对照品、阴性对照品各10～25mg，同法制成阳性对照品溶液和阴性对照品溶液。②PCR扩增：扩增体系为25 μL，包含预混反应溶液24 μL，待测样品或阳性、阴性对照DNA模板1 μL。扩增程序为94 ℃预变性1 min；再进行28个循环反应，条件为88 ℃变性10s，62 ℃退火并延伸10 s。以无菌双蒸水作为空白对照，取1 μL，同法扩增得到空白对照PCR扩增产物。③检视方法：在PCR扩增产物中加入2 μL溶液荧光染料(SYBR Green I)混匀，于紫外光(365nm)下检测荧光。若显示绿色荧光，则为阳性结果，即为乌梢蛇正品，反之则为阴性结果，即伪品。

3 结果

3.1 乌梢蛇PCR快检试剂盒性能检测结果

3.1.1 特异性 采用快检试剂盒法，乌梢蛇正品、伪品检测结果均与标定值一致。如图1所示。

1.WS1; 2.WS2; 3.WS4; 4.WS5; 5.WS7; 6.WS9; 7.W1; 8.W2; 9.W4; 10.W5; 11.W8; 12.W9图1 乌梢蛇PCR快检试剂盒特异性检测结果

3.1.2 检测限 取WS1，按“2.1.2”进行试验，结果本试剂盒方法检出限为4 mg。

3.1.3 重复性 经检测，不同生产批号的快检试剂盒测定的结果一致，不同操作人员的检测结果亦一致，表明该试剂盒重复性良好。

3.1.4 稳定性 经检测，反复冻融1、5、10次后，经试剂盒提取的供试品DNA测定结果一致，表明该试剂盒稳定性良好。

3.2 乌梢蛇PCR快检试剂盒应用评价结果 分别采用“药典法”和“快检试剂盒法”对市售乌梢蛇样品86批(包括乌梢蛇粉12批、乌梢蛇饮片29批、酒乌梢蛇样品42批，药材样品3批)以及伪品饮片50批进行检测，结果见表2。结果不一致的批次经复试，复试结果与初试结果一致。

表2 乌梢蛇PCR快检试剂盒与药典法结果汇总

以“药典法”检测结果为标准结果，测定阳性标准结果为76批，阴性标准结果为60批，“快检试剂盒法”测得阳性结果为74批，阴性结果为62批，阳性结果准确率为93.4%，其中酒乌梢蛇样品中有5个批次阳性样品“快检试剂盒法”测定结果为“阴性”，假阴性率为6.6%；阴性结果准确率为95.0%，其中乌梢蛇伪品样品中有3个批次阳性样品“快检试剂盒法”测定结果为“阳性”，假阳性率为5.0%。

4 讨论

4.1 试验样品的代表性 本研究用于考察乌梢蛇PCR快检试剂盒应用评价的样品收集于流通领域中的生产企业、药店、医疗机构、药材市场等16家，样品规格有乌梢蛇粉、乌梢蛇饮片、酒乌梢蛇、乌梢蛇药材等不同状态的样品，覆盖了流通领域中各种使用规格，其中正品76批，伪品60批，总批次数136批，具有较好的代表性。其中乌梢蛇市售样品不合格率分别为11.6%，表明市售乌梢蛇质量情况不容乐观，开展现场快筛快检技术和产品的应用以进一步提高监督效能十分必要。

4.2 试剂盒的性能评价 经对试剂盒的特异性、重复性、稳定性及检测限等性能指标进行考察，结果表明该试剂盒的特异性、重复性和稳定性良好，检测限(最低取样量)为4 mg。而“药典法”在增加裂解时间的前提下，检测限约为10 mg，因此与“药典法”比较，该试剂盒的检测限仅为“药典法”的二分之一。对于乌梢蛇这类价格较为昂贵的品种，检测限低既可减少检测成本，同时对于常见的以拼接等制伪手段制成的样品，可以多部位取样及增加取样个数，进一步提高监督力度。

4.3 试剂盒的应用评价 经采用快检试剂盒对136批样品进行试验，并与“药典法”结果相比较，阳性结果准确率为93.4%，阴性结果准确率为95.0%，假阳性率为5.0%，假阴性率为6.6%，总体准确率为94.1%。对假阴性结果和假阳性结果进行分析，可能与检视方法有关，由于乌梢蛇PCR快检试剂盒采用在扩增产物中加入荧光染料(SYBR Green I)，混匀后在紫外光灯(365 nm)下检视，荧光较弱的情况下可能会影响主观判断，造成假阴性或假阳性的结果。在这种情况下，可采用“药典法”进行进一步确证。与“药典法”相比，该试剂盒取样量少，简便快速，使用成本低，作为快速检测产品，乌梢蛇PCR快检试剂盒可在监督现场进行大批量快检初筛，为打击乌梢蛇掺假、售假提供的有效的方法和工具，亦为监督执法赢得了时间。

综上，研究以中国药典2015年版一部乌梢蛇质量标准项下收载的PCR鉴别方法作为对照，对乌梢蛇PCR快检试剂盒的性能与应用进行评价。乌梢蛇PCR快检试剂盒采用碱裂解法提取乌梢蛇基因组DNA，基于快速PCR技术，以SYBR Green I荧光检视代替琼脂糖凝胶电泳，将检测时间缩短至30min以内。与药典收载的PCR法相比，具有操作简便、耗时短、检测限低、经济实惠等优势。通过对136批乌梢蛇样品及常见混伪品进行试验，结果表明该试剂盒可用于监督现场快速筛查，以提高市场监督、执法的效率。本文亦为同类产品的应用与评价提供了研究经验。