脓毒症与相关生物分子关系的临床研究进展

张敏李倩

(皖南医学院弋矶山医院急诊科,安徽芜湖241001)

脓毒症 (sepsis)的最新国际共识是指宿主对感染的失控反应,并引起严重危及生命的器官功能障碍[1-2]。在感染或可疑感染的基础上对ICU和非ICU患者给出了不同的诊断标准。ICU患者序贯器官功能衰竭评分 (SOFA)≥2分,非ICU患者快速序贯器官功能衰竭评分 (qSOFA)符合2项及以上时即可诊断为脓毒症[2]801-810。因其具有多病因、多影响因素、发病机制复杂等特点,治疗上一直没有突破性的进展。分子水平研究给脓毒症的治疗和预后评估带来了新方向。本文重点综述脓毒症生物分子水平的最新研究成果。

1 脓毒症与DNA

血浆游离DNA(cfDNA)是存在于血液、脑脊液等体液中片段化、具有较低分子量的DNA,由凋亡细胞、坏死细胞释放而来。正常情况下细胞凋亡释放的cfDNA数小时内会被清除,因此正常人cfDNA在较低水平维持动态平衡。因为cfDNA的半衰期较短,我们可以将测得的数值作为经机体平衡后的实时含量。脓毒症时,病原体入侵机体导致抗炎和促炎反应的失衡,多种炎症介质的释放相互作用形成网络效应导致多系统多器官损伤。细胞被动裂解增多、cfDNA清除降低等使得cfDNA含量异常增高为其可能机制,且机体受损伤程度与其增高水平呈正相关。这不同于以往的监测标记物如PCT、CPR等。它们主要反应促炎细胞因子水平、微生物产物水平[3],不能对脓毒症患者做出准确的预后评估。因此cfDNA水平的监测可能成为诊断和评估脓毒症的一个可靠指标。由于脓毒症没有明显的疾病前兆,而在脓毒症发生的前6 h对患者采取积极的干预措施可以显著降低患者病死率[4-5],因此这一监测指标尤为重要。银雪等[6]人对31例全身炎症反应综合征 (SIRS)和35例脓毒症患者进行cfDNA含量监测,并以17例健康者cfDNA含量作为对照样本。研究发现对照组和SIRS组cf-DNA显著低于脓毒症组,入院时的SOFA评分与第1天cfDNA浓度呈正相关。经过进一步分析后,他们认为cfDNA的定量监测可作为临床治疗效果和脓毒症患者预后评估的指标。若以cfDNA浓度＞8 939 GE/mL作为诊断脓毒症的截断值,其特异性和敏感性分别为80.65%和77.14%。目前,国内外还没有研究发现能对脓毒症进行早期识别的高敏感性的特异性监测指标。cfDNA对脓毒症患者的临床实用性和其预测价值仍有待进一步的研究。

2 脓毒症与RNA

2.1 微小RNAs(microRNA)

microRNAs(miRNAs)是一类内源基因编码的小RNA,可通过多种方式参与调控蛋白编码基因的表达,约由22～27个核苷酸构成。据推测,人类约1/3的基因表达受到miRNAs的调控[7]。当病原微生物入侵机体后,宿主细胞会产生大量miRNAs参与机体固有免疫应答[8]。这为其治疗提供了新思路。通过反转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)比较健康对照组和早期脓毒症组血浆中miRNAs的表达量发现两组间部分miRNAs存在明显差异。这可能预示miRNAs会成为诊断脓毒症的新近生物标记物。研究发现,多种信号通路如核因子κB(NF-κB)通路、Toll样受体 (TLRs)信号途径、JAK激酶/信号转导和转录激活子 (JAK/STAT)通路等都参与了脓毒症的病理过程。不同的JAK/STAT信号通路在脓毒症的病理过程中介导不同的作用,其中JAK4/STAT6通路的激活可改善患者症状,降低病死率。miR-223可能通过调控START3通路从而调节IL-1β和IL-6介导的炎症反应[9],在NF-κB通路中 miRNA-223参与对 IκB激酶 α(IKKα)的抑制从而减少了IL-12和IL-6的释放,当细菌LPS入侵宿主细胞时,miRNA-233下调促进炎症因子的释放,参与早期促炎反应。有研究表明,相对于PCT、CRP,miRNA-233对脓毒症的预测灵敏度最高[10]。当机体经TLRs信号途径识别病原体后,可介导miRNA-146a的表达调节急性炎症反应。适量释放的促炎因子可促进中性粒细胞募集以清除细菌,miRNA-15a、miRNA-16的过度表达会抑制TLR4通路介导的促炎因子的释放。有研究称,与 CRP、PCT比较,miR-15a用于鉴别SIRS和脓毒症具有更好的敏感性和特异性。

2.2 长链非编码RNA(lncRNA)

多器官功能障碍是脓毒症最新定义的重点指向。其中心功能障碍为脓毒症患者最严重的并发症之一,也是脓毒症患者的主要死因之一。lncRNA是长度在200～100 000个核苷酸之间的非编码RNA。以目前的研究成果,我们仍需加强对lncRNA的研讨,临床上在循环系统的运用主要集中在寻找特异性的lncRNA生物标记物和其作为潜在的药物治疗靶点。脓毒症时促炎因子的分泌是心肌损伤的根本原因,有研究表明TNF-α是一种能够引起心肌延展性和收缩峰值速率下降的促炎因子。lncRNA可通过间接调节细胞因子如IL-1β、TNF-α等从而调控心肌损伤。在对感染小鼠骨髓源性巨细胞的RNA研究中发现多种lncRNA表达水平增高,其中lncRNA-环氧化酶2(COX2)升高最明显。lncRNA-COX2可通过调节TLR-NF-κB通道促进炎症发展。Li等[11]研究发现,其他lncRNA如linc0206、linc 3995、linc7190和linc7705均参与了调节TNF-α或 IL-6的水平但其机制未知。另一方面,Ca2+浓度的变化不仅直接影响心肌兴奋收缩耦联还可以调节细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的释放。在一定水平内的Ca2+浓度升高可以增加心肌收缩力,但若线粒体内Ca2+超载则会导致不可逆的损害甚至细胞死亡。在对果蝇的研究中发现[12],多种lncRNA通过肌质网的ATP酶参与调节Ca2+浓度从而调控心肌功能。然而在脓毒症中,lncRNA通过何种方式调节心肌细胞尚需进一步研究。

3 脓毒症与基因编码的蛋白质

3.1 程序性死亡受体 (PD-1)

基因表达的完整性取决于转录、翻译、蛋白质空间构象的改变等一系列过程,蛋白质是mRNA翻译后的加工产物,那么对蛋白质进行人为的干预修饰会直接影响着基因的表达。随着基因研究的不断深入,人们逐渐意识到某些基因编码的蛋白质经人为干预后可调节脓毒症的炎症反应。有动物实验表明,在脓毒症早期阶段免疫系统即受到抑制[13]。这对预防组织过度炎症反应极其重要。PD-1作为CD28超家族成员中一种重要的免疫抑制分子,可与B7家族中PD-L1结合。PD-L1主要表达于抗原呈递细胞表面如树突状细胞、单核巨噬细胞等。当抗原呈递细胞表面高表达PD-1时会出现免疫耐受,影响树突状细胞抗原呈递能力,导致单核巨噬细胞吞噬能力降低等。有研究发现,在脓毒症患者外周血中发现一类PD-L1+抑制表型中性粒细胞亚型,可通过细胞-细胞直接接触方式抑制T细胞功能[14]。最新研究[15]认为PD-1/PD-L1可导致T细胞耗竭。PD-1与T细胞膜上PD-L1配体结合使T细胞呈无应答状态和 (或)凋亡。有研究认为,中性粒细胞膜上高表达的PD-L1可以作为脓毒症患者出现免疫抑制的更好的生物标记物[16]。自然杀伤细胞在机体抗肿瘤、抗感染和免疫调节等过程中发挥着重要作用,是机体重要的免疫细胞能够识别靶细胞、释放杀伤介质。有研究发现,在感染单纯疱疹病毒后,患者自然杀伤细胞膜上出现PD-1高表达现象,而PD-1+NK细胞抗感染、抗肿瘤能力均显著降低[17]。因此有学者认为PD-1/PD-L1可以决定脓毒症患者免疫状态,是导致患者出现不同结局的关键因素。或许可以通过调节PD-1/PDL1的表达来调控机体免疫平衡以改善脓毒症患者预后水平。

3.2 高迁移率族蛋白Bl(HMGBl)

现阶段临床医师在对脓毒症患者进行治疗时,主要的干预措施是早期的液体复苏和控制感染,然而针对早期致炎因子如IL-1、TNF等的治疗效果并不令人满意。因为早期炎症因子在炎症反应开始数小时后就恢复到基础水平而炎症的损害却一直持续。作为细胞核内非组蛋白的HMGB1是一种晚期促炎因子,具有3个独特的结构域,分别为A-box、B-box和C-端。其中B-box是HMGB1发挥炎症作用的功能区,A-box是B-box的拮抗位点可作为潜在的 HMGB1的拮抗剂,C-端是调节HMGB1与 DNA相互作用的重要结构[18]。同时HMGB1自身也可作为促炎因子,在脓毒症病理过程中与TNF-α、IL-1、IL-8等炎性因子在炎性反应通路上形成一个促炎的正反馈环路,通过破坏炎症反应中促炎细胞因子和抵抗炎症的抗炎细胞因子之间的动态平衡导致炎症级联信号放大。对小鼠脓毒症的实验中发现其HMGB1含量增加明显且不管小鼠对LPS是否敏感,将重组HMGB1经腹腔注射到小鼠体内后,小鼠均死亡。因此推测HMGB1可能是导致小鼠死亡的直接原因而并非LPS。大量临床研究中发现,脓毒症病人的血清中HMGB1水平明显高于正常人且其升高水平与APACHEⅡ评分、qSOFA评分对于脓毒症患者评估的严重程度呈正相关。大多数脓毒症患者住院7 d后其血清HMGB1浓度仍处于较高水平。在因脓毒症死亡的患者中发现相对于其他炎症因子如TNF、IL-8等血清HMGB1浓度高达数百倍,从而说明HMGB1水平与脓毒症休克患者的病情进展及预后密切相关[19]。因此动态检测HMGB1水平有助于对患者预后的评估和调整治疗方案,同时也为脓毒症的抗炎治疗提供了一个更好的新靶向,具有重要的意义。

3.3 可溶性白细胞分化抗原14亚型 (sCD14-ST,即Presepsin)

CD14是存在于单核细胞和巨噬细胞表面的一种白细胞分化抗原,以膜结合 (mCD14)型和可溶性 (sCD14)两种不同的形式存在于体内。sCD14是一种由348个氨基酸构成的糖蛋白,高达机体总CD14含量的99%。当机体发生感染时,mCD14或sCD14被血浆中激活的组织蛋白酶裂解后产生一种相对分子质量为13 000的片段即为sCD14-ST。Presepsin作为LPS结合蛋白的受体不仅可直接参与机体体液和细胞免疫反应,起到LPS信息呈递作用来促进单核细胞分泌TNF-α等各种细胞因子介导一系列免疫炎症反应,更重要的是促进LPS向脂蛋白转移[20]并促进单核细胞、巨噬细胞吞噬脂多糖结合蛋白以清除细菌及内毒素。目前,PCT在脓毒症患者的治疗和预后评估[21]中具有较高的应用价值。有研究表明PCT在脓毒症的诊断上的特异性和敏感性均高于Presepsin。Masson[22]等证明了Presepsin水平对脓毒症患者的病情判断及预后评估方面优于PCT。然而Presepsin会受到如年龄、肾损伤等因素的影响,因此与其他生物分子联合诊断可能是较好的解决方法[23]。以Presepsin作为诊断的截断值设定还需要大样本的研究提供依据。

4 结语与展望

在脓毒症的发生发展中遗传和环境是两个重要的影响因素。临床治疗策略目前还没有突破性进展,主要原因是其病理过程涉及到复杂的全身炎症网络效应、机体免疫功能和患者对病原体的易感性等多个方面且具体发病机制尚不明确。对于脓毒症生物分子水平的研究仍在继续,无论是在转录水平、转录后水平还是在翻译水平都取得了一定的成果。尽管目前CRP、PCT等在临床上已经普遍应用于对脓毒症患者的评估并指导临床医师的决策,但脓毒症的发生率和病死率并没有得到明显改善。寻找具有高特异性和高敏感性的生物分子以区分是否因感染引起的全身炎症反应相关的多器官功能障碍更具有挑战性。随着分子生物学的不断发展,更多免疫学、基因学方面新的特异性标记物将被发现,弥补了单纯炎症标记物的不足,并将给临床医师一个更准确的参考标准和更好的治疗手段。但是就目前对于脓毒症的研究成果来说,还需要大样本随机对照试验来验证以使其更具普遍性和科学性。这样才能广泛应用于临床为脓毒症患者的诊断及预后提供更好的参考标准。