液体活检在膀胱癌中的研究进展

程 亮，李泉林，陈奇伟

(1.美国印第安纳大学医学院病理科；2.美国印第安纳大学泌尿外科；3.大连医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁大连 116011)

在美国，膀胱癌发病率在男性恶性肿瘤中位于第4位、女性中位于第9位[1]。膀胱癌呈异质性表现，但组织学上分为低级别和高级别。大约70%～75%新诊断的膀胱癌是非浸润性的，这其中超过50%是低级别的[2]。这些肿瘤有大约34%的复发率，低于15%发展为浸润性肿瘤[2]。这与高级别尿路上皮癌形成鲜明对比，高级别尿路上皮癌大约有70%复发，在1年后有5%患者出现临床进展。非肌层浸润性膀胱癌的特点是复发率较高，5年生存率为90%。与之相反，肌层浸润性膀胱癌超过50%患者出现转移，中位生存期为13～20月。

最近通过二代高通量基因技术，例如TCGA，已经确认了一些有意义的分子标记物，包含拷贝数异常、体细胞突变，mRNA和microRNA表达、DNA甲基化、转录剪切位点异常和基因融合[3]。然而，发现肿瘤基因异常是通过石蜡包埋组织及新鲜冰冻组织，由于肿瘤的异质性，因而少量组织活检可能不能代表侵袭性最强的亚群。近来基于血液和体液(例如:尿液)中的循环肿瘤细胞、细胞游离核苷酸(细胞游离肿瘤DNA，循环RNA和外泌体)的液体活检备受关注。在膀胱癌患者中，肿瘤释放循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)和细胞游离肿瘤DNA(ctDNA)入血液或者尿液[4]。CTCs是肿瘤细胞从原发灶或者转移灶进入血液的，具有无创并且实时监测肿瘤的分子变化。ctDNA是由血浆或者尿液中很小片段的DNA形成，其中包含肿瘤特异性基因序列，并且可能作为特异性标记物[5]。从血液和尿液分离和分析肿瘤细胞以及DNA代表着一种新颖的早期无创诊断手段，并且能进一步监测复发以及对尿路上皮癌治疗的敏感性反馈。

本文旨在概括和讨论现行的液体活检及其临床应用，特别是与膀胱癌分子标记物的相关方面研究，从而创造膀胱癌新的诊断方式、预后评估以及个体化精准治疗。

1 循环肿瘤细胞(CTCs)

CTCs是指从肿瘤原发灶或者转移灶脱离进入到血流中的细胞。它在正常循环细胞中含量很少，在肿瘤转移患者中大约1×109血细胞含1个循环肿瘤细胞，因而需要特异性方法去检测[6]。检测的第一步是分离CTCs，现在有很多手段，包括过滤法，免疫磁珠法以及微流控芯片法[7]。目前，临床中分离CTCs最广泛的方法是免疫磁珠法，通过在磁珠上加载与CTCs抗原对应的特异性抗体来捕获CTCs。比如在尿路上皮癌细胞中，最常用的阳性筛选CTCs的抗原是上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，一旦被捕获住，这些细胞将用CK、CD45和DAPI染色。其中EpCAM、CK染色阳性，CD45染色阴性考虑为CTCs[8]。

在临床中CTCs检测已经在多种膀胱癌中应用，并且与患者生存期及治疗应答相关。GAZZANIGA等[9]报道在非肌层浸润患者中有8/44(18%)被检测到CTCs，而这些出现CTCs的患者都与高分期以及原位癌有关。GALLAGHER等[10]发现在转移膀胱尿路上皮癌中CTCs相对数目较低，但是在有2处或者多处转移的患者发现更多CTCs。ALVA等[11]证实对于进行新辅助化疗而后进行根治性膀胱全切的患者，CTCs >10是预后不良(pT1或者更高)的指标。然而，也有反对这些结果的研究，GUZZO等[12]证明CTC并不是膀胱外侵袭和淋巴结阳性的预测指标。大部分相关研究的实验只占膀胱尿路上皮癌患者的一小部分，因而CTCs的特异性和敏感性还需要大样本前瞻性实验来评估。

目前，通过单细胞高通量基因或者蛋白技术检测CTCs理想的分子标记物是临床研究热点。单细胞序列一般分为以下几步：单细胞分离，核苷酸抽取和纯化，序列库准备，生物信息库分析。YANG等[13]对59个细胞进行单细胞测序，从3个膀胱癌患者中提取膀胱癌干细胞、膀胱癌非干细胞、膀胱上皮干细胞、膀胱上皮非干细胞。研究发现了21个膀胱癌关键基因突变，包含了5个功能性通路：细胞周期调节，转录调节，染色体重构，细胞分化和自我更新。单细胞序列可以应用于区分肿瘤细胞和正常血细胞，并且同时能获得肿瘤细胞的表达序列。在未来从CTCs单细胞序列中提取的分子序列能够对患者的预后和疾病进展以及治疗抵抗等提供信息，并且为直接靶向治疗服务。

2 血浆循环细胞游离肿瘤DNA

所有的细胞，包括正常以及肿瘤细胞，都散发DNA，被称为细胞游离DNA(cfDNA)。ctDNA是循环系统中肿瘤细胞散发的cfDNA。ctDNA是长度180～200碱基对的DNA片段[14]。ctDNA如何释放入血的机制目前还不清楚，ctDNA主要来源考虑为细胞凋亡[15]。除此之外，还有活肿瘤细胞释放入血的小泡(外泌体)，另外，巨噬细胞吞噬坏死肿瘤细胞也可以释放ctDNA[14]。

ctDNA包含肿瘤特异性基因突变体，因而可能作为独一无二的基因标签和标记物。ctDNA相比于肿瘤活检有很多优势，由于肿瘤异质性很大，因而组织活检只是肿瘤组织一个时间一个部位的“快照”[16]。而ctDNA很可能是来源于肿瘤所有位点，而且有希望更准确地实时从肿瘤间以及肿瘤内检测患者疾病进展。

ctDNA诊断的主要挑战是从成千上万的野生型DNA(正常)拷贝中确认和追踪极少量的突变DNA片段。这些困难可以通过二代测序或者应用突变特异性聚合酶链反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)(数码PCR)来克服。二代测序可以迅速获得大量基因数据但是需要消耗很多时间进行数据分析[17]。而数码PCR上千个PCR同时进行，每个区域的评估是个体化实时进行，但是，每个数码PCR(dPCR)只针对于一个特异性突变，需要根据二代测序结果个体化设计。不过如果建立，相比于二代测序，个体化的dPCR序列是高特异性及敏感性、快速、经济的手段。

很多研究关注膀胱癌中ctDNA的应用。BIRKENKAMP-DEMTRODER等[18]回顾性检测了12个非肌层浸润性患者的血清和尿液(6个复发，6个进展)。通过二代测序检测基因突变，将高肿瘤特异性的基因突变制成个体化适用于dPCR的序列检测其余患者的血浆及尿液。12个患者中有10个患者检测到ctDNA(83%)，4/6(67%)ctDNA检查阳性的患者在几个月后检查临床进展。因而证实这个手段可以用于早期检测及疾病预后预测。随后，该实验室针对膀胱癌患者体液活检进行FGFR3和PIK3CA突变检测。这些患者术前(膀胱切除术)术后的样本均被保留。8/9(89%)可以检测到ctDNA的患者出现复发，证实患者血浆中高水平ctDNA与高复发相关。与二代测序后联合个体化序列手段相比，热点突变序列更快捷和经济。未来临床上需要更多大样本的随机对照试验来验证现在的发现[19]。

GOOTENBERG等[20]联合Cas13a酶建立CRISPER为基础的诊断系统，命名为SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)，这套系统可以在微摩水平检测单链ctDNA。随着检测技术的增高，膀胱癌中ctDNA的应用会越发重要。

3 尿液细胞游离肿瘤DNA

尿液同样中也发现ctDNA，可能对部分膀胱癌诊断有效。膀胱癌患者尿液中主要的ctDNA主要来源于肿瘤细胞释放，并且比血浆中浓度高，因而更容易检测[21]。

一些研究也关注这个无创的基因检测手段。KINDE等[22]通过肿瘤特异性序列TERT评估14个早期膀胱癌患者，通过TERT是否阳性预测疾病是否复发。在和组织病理相符的TERT阳性患者中，7/8(88%)患者复发，而未测到TERT的患者没有复发。DAHMCKE等[23]检测热点突变(TERT和FGFR3)以及其余重要的甲基化基因(SALL3，ONECUT2，CCNA1，BCL2，EOMES，VIM)来验证针对肉眼血尿时是否能替代膀胱镜检查。在96/99(97%)尿路上皮癌患者中检测到肿瘤特异性DNA，在87/376(23%)患者中没有临床肿瘤的证据(敏感性97%，特异性77%，阴性预测率99%，阳性预测率53%)。WARD等[24]最近研究了一种复合PCR和二代测序的技术手段，可以多种基因在一个单独序列同时间进行检测。这个技术检测323个患者6个热点突变基因(FGFR3，TERT，PIK3CA，TP53，HRAS，RXRA，KDM6A)来评估其可靠性。检测到86/122(70%)肿瘤患者以及3/109(3%)临床没有肿瘤的患者(10%敏感性，97%特异性)。虽然这些领先的研究需要对结果进行大量的分析以及验证，但还是为膀胱癌尿液ctDNA检测铺平了前进的道路。

尿ctDNA也用于膀胱癌预后的评估，BIRKENKAMP-DEMTRODER等[18]基于二代测序设计的个体化阵列检测101尿液样本。他们检测到55/57(97%)临床进展的患者。反而只有22/44(50%)复发患者的尿液样本出现ctDNA。另外，与复发组相比，临床进展组ctDNA水平更高。同时，该研究组通过dPCR检测膀胱癌尿液样本肿瘤特异性热点FGFR3和PIK3CA突变。他们发现非肌层浸润性尿液ctDNA水平很高，因而能早期检测疾病进展到非肌层浸润性膀胱癌。以上结果显示膀胱癌中尿液ctDNA比血浆更为敏感。

外泌体是(30～100 nm)细胞膜小泡，是细胞外环境中细胞外小泡的亚群[25]。有几种方法可以检测外泌体。比如超速离心，电子显微镜观察或者特异性蛋白标记物CD63、CD9、CD81[26]。它其中的蛋白包含核苷酸，包括DNA、mRNA、miRNA，推断在和细胞融合时可能调节细胞活动[27]。外泌体内容物有希望成为肿瘤标记物。从患者身上提取外泌体可以检测突变、剪切突变、基因融合以及基因表达序列。来源于高表达基因的mRNA可能以很高的浓度在循环中释放外泌体。因此，外泌体的分离和分析可能比ctDNA更有优势。外泌体是RNA、DNA稳定的载体，而且似乎在肿瘤患者中都呈升高趋势[28]。

FRANZEN等[29]证实分离肌层浸润性患者尿液的外泌体能够诱导尿路上皮细胞上皮间质化，为非肌层到肌层浸润中外泌体的作用提出新的观点。BERRONDO等[30]发现通过EDIL3通路，高级别膀胱癌患者尿液提取的外泌体促进尿路上皮细胞迁移和血管生成，也证明了外泌体在肿瘤进展中的作用。

虽然是有希望的肿瘤标记物，但是由于生物样本的复杂性，与其余细胞外小泡并存以及缺少经济和准确的分离检测手段，使得外泌体进入临床应用的脚步放慢。现行的外泌体分离金标准超速离心费时费力。因而需要发展更敏感的捕获外泌体的平台来帮助寻找膀胱癌特异性miRNA和mRNA标记物。

4 循环RNA

RNA包含很多种类，包括miRNA，mRNA和长链非编码RNA，以上都已经被证实可以作为膀胱癌潜在的标记物[31]。由于对lncRNA缺少mRNA稳定性以及相应的深入理解，我们本文只关注循环miRNA。miRNA是18-24核苷酸长的单链非编码RNA，通过抑制mRNA靶点而在转录后调节基因表达，因而可以调节细胞周期、凋亡以及增殖[32]。miRNA存在于血浆及尿液中，可能与核糖核蛋白复合体连接，或者在细胞外小泡中(外泌体)，以游离循环miRNA形式被检测到。值得注意的是，体细胞DNA突变并不能代表肿瘤细胞整个分子变化，肿瘤基因表达谱的改变可能是因为miRNA对表观遗传学的影响，而这种改变ctDNA是无法检测和分析的，因而，miRNA可以提供很有价值的信息，miRNA和实时PCR为基础的技术用于研究miRNA。

miRNA在血中的组成成分似乎与肿瘤的起源相关。最近有研究显示一些特异性的miRNA在肿瘤生成中起到重要作用，因而在未来可以被用作膀胱癌诊断、预后评估甚至治疗效果评测的标记物[32-34]。RATERT等[35]发现肿瘤抑制子miR145在膀胱癌中最普遍下调的miR141和miR-205是膀胱癌是预后不良的标记物。YOSHINO等[36]显示miR-145、miR-143、miR-125b这些肿瘤抑制子在一些类型的膀胱癌中是下调的，然而促癌的miR-183、miR-96、miR-17-5p、miR-20a是上调的。ROSENBERG等[37]发现肿瘤抑制子miR-29c表达水平在进展性膀胱癌中严重下降。一半的低表达miR-29c的非肌层浸润性膀胱癌随后进展为肌层浸润性膀胱癌，然而94%高表达miR-29c的患者却没有进展。SASAKI等[38]证实尿miR-146a-5p在膀胱癌患者中升高，而且浓度与肿瘤分级和浸润深度相关。

miRNA无法在标本中持续地存在，并且每次检测的miRNA都不尽相同，这些缺点限制了miRNA在临床上的应用。未来仍需要多中心系统性的研究来确认目前的研究结果。

5 未来展望及结论

虽然通过CTC、ctDNA、外泌体和miRNA进行膀胱癌分子诊断迅速发展，但仍需要多中心大样本试验来验证其临床应用价值。随着新技术的不断开发，我们相信分子诊断会广泛应用于临床实践中，并且成为膀胱癌监测、预后评估、治疗效果评判的有力工具。