感染性疾病病原学诊断新技术与临床应用策略

张坚磊，马小军

1天津市第一中心医院检验科， 天津 3001922中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院感染内科， 北京 100730

感染性疾病仍是威胁人类健康的主要疾病，根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)发布的数据，患感染性疾病死亡人数占全球死亡总人数的28%[1]。由于传统病原学诊断滞后，难以满足感染性疾病的诊疗需要，故WHO提出[2]，临床微生物实验室应尽可能把目标集中于快速诊断方面，利用一切手段将实验室数据转化为临床有用的信息。近年来，基于非培养的新型诊断技术平台正在迅速发展，给感染性疾病的诊断带来了重大变革，包括检测时间缩短、操作简便及检测准确度和精密度有所提升等，给临床应用带来了希望。临床微生物室一方面需不断采用新的病原学诊断技术，提高临床诊断效率；另一方面还需培养临床医生正确解读报告的能力，提高诊断准确率，使病原学诊断新技术真正解决临床诊断问题，进而提高抗菌药物靶向治疗的及时性，改善患者结局。

1 病原学诊断新技术

1.1 即时检验

即时检验(point-of-care testing，POCT)指在患者初诊时，短时间内便可提供诊断信息，使患者迅速得到治疗，减少对经验治疗的依赖，从而促进抗生素的管理，减少感染传播，控制感染性疾病的流行。感染性疾病的POCT始于免疫层析法，目前最常用的是侧流免疫层析法(lateral flow immunoassay， LFIA)。随着分子诊断技术的发展，实时聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)技术可以满足POCT速度快、成本低、易于操作的要求，成为POCT另一大主流方法。POCT还可提高经济不发达地区感染性疾病的诊断能力[3]。

1.1.1 以侧流免疫层析法为基础的即时检验

以 LFIA为基础的POCT的检测原理为：临床样本中微生物抗原与标记抗体结合，抗体-抗原复合物在固体基质通过毛细作用侧向流动，在反应区产生可见的信号，而过量的标记抗体继续迁移通过第二次抗体捕获，导致出现第二条颜色带，15 min内便可得到直观结果[4]。因其操作简单、快速、无需或仅需简单的仪器，操作人员无需培训，非常适合现场检测。随着免疫标记技术的发展，免疫标记物新型材料(如磁颗粒、荧光微球、量子点、上转换荧光粉、碳纳米颗粒、铕纳米颗粒等)显著提高了检测灵敏度，可实现定量检测；而试纸阅读仪通过将检测线和质控线的颜色强度转变为光密度值，可实现定量分析。已有使用智能手机作为试纸阅读器，利用内置软件进行定量分析的报道[3]。LFIA 在快速病原学检测如肺炎链球菌尿抗原、军团菌尿抗原、A群溶血链球菌、流感病毒抗原以及隐球菌荚膜多糖抗原检测方面比较成熟。以隐球菌多糖抗原为例，WHO在关于儿童、青少年和成人人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者隐球菌病诊断、预防和管理快速推荐中指出，隐球菌病是HIV相关机会感染中最主要的感染之一，也是造成早期死亡的主要原因之一[5]。诊断延迟导致脑膜炎发展至晚期，治疗效果较差是这一现象的主要原因。因此，WHO于2011年推荐采用 LFIA检测隐球菌多糖抗原，对患者的脑脊液、血清或血浆进行筛查，针对阳性者给予预防性氟康唑治疗，目的在于通过快速诊断、预防用药，降低隐球菌的发病率和死亡率。

1.1.2 以实时聚合酶链式反应为基础的即时检验

LFIA对抗原检测的性能依赖于临床样本中分析物的浓度。分析的浓度低于浓度检测范围可能产生假阴性结果。最近美国疾病预防控制中心在流感高发期，将流感病毒LFIA法与RT-PCR及病毒培养对比，提出对于流感病毒抗原检测的阴性结果需谨慎解读[6]。

为了提高POCT在病原学快速诊断中的敏感度，将分子诊断应用于POCT，使感染性疾病的诊断有了革命性变化。POCT分子诊断技术主要基于RT-PCR。RT-PCR技术是一种定量测定样本中特定DNA序列的PCR。使用标记的PCR引物, 病原模板需95 ℃变性，低温60 ℃左右复性，72 ℃延伸为一个PCR循环，需要经过30～40个循环扩增，在每个周期内放大，反应需要20～100 min，从而增加测试敏感度和特异度，但需要特定的设备，限制广泛应用。而环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP) 是一种RT-PCR新的替代方法，LAMP法的特征是针对靶基因上的6个区域设计4条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温60～65 ℃条件下进行扩增反应，可在15～60 min内实现109～1010倍的扩增，产生大量扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，通过肉眼观察有无白色沉淀以判断是否存在靶基因。该技术不需要热循环器，比PCR便宜、节能、操作简便，更适于在经济不发达地区使用，当前主要应用于疟疾和结核病的快速诊断[7- 9]。RT-PCR比免疫层析法更敏感，但对技术和培训程度要求更高，这可能会限制在不发达地区的使用。目前，病原学分子诊断检测主要涉及[10]如艰难梭菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体、性传播性疾病病原体、常见呼吸道病毒及肠道病毒的检测，肝炎病毒的定量检测和寄生虫检测。

近年来快速高度自动化病原学分子诊断平台(如GeneXpert和FilmArray等)发展迅速，这些平台均是基于核酸扩增检测原理。GeneXpert平台是基于PCR方法的全自动一体化核酸检测系统，将整合样品制备、扩增及检测3个步骤集中于一个独立试剂盒中，并进一步自动化和模块化；其可检测结核分枝杆菌、利福平耐药菌、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等项目。而FilmArray平台则采用巢式多重PCR以及熔解曲线测定方法进行病原体靶标快速检测与分析；通过阵列将每一种靶标的扩增反应分隔到单孔完成，并且针对每一种靶标设有3个重复，检测结果更准确；仪器与测试条均为全封闭系统，核酸提取纯化、PCR扩增与产物检测均在一台仪器中完成，同一测试可检测多种病原。该产品按疾病系统分为上呼吸道感染测试(19种病毒和3种细菌)，胃肠道感染测试(13种细菌、5种病毒和4种寄生虫)以及脑膜炎/脑炎测试(6种细菌、7种病毒和1种真菌)，提供了一种全面、快速、流线型的替代方法，其检出病原体的覆盖范围广，准确度和特异度比传统培养及PCR更高[11- 13]。病原学分子诊断将不断被探索和应用于临床。

目前POCT产品种类繁杂，检测原理、操作方法、质量控制与校准方式及周期差异均极大，不同产品检测结果不可比，也为临床准确诊断与治疗带来了极大挑战。针对POCT质量管理体系建设，世界各发达国家均给予了极大关注。

1.2 快速微生物鉴定系统质谱技术[14]

1906年，英国物理学家Thomson研制出世界首台质谱仪，当时作为一种化学分析手段。20世纪80年代，软电离技术的发明使检测相对分子质量高达几十万的生物大分子成为可能，从而开拓了质谱学的崭新领域——生物质谱。生物质谱迅速成为微生物鉴定领域的新宠，基质辅助激光解吸电离质谱(matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术即是其中之一。其原理为：样品同基质溶液混合后形成样品结晶，结晶体被装载至质谱仪后利用激光轰击结晶体，基质从激光中吸收能量使得样品解吸电离导致离子化分子在电场中飞行，不同质荷比的离子因到达检测器的时间不同而被分开。通过构建的细菌鉴定质谱图与数据库图谱比对，从而可将各种细菌进行鉴定区分。MALDI-TOF-MS技术与传统方法相比，具有操作简单快速、重复性强、灵敏度高、准确度好、自动化和高通量等特点，临床主要应用于细菌、真菌的快速鉴定与分类。一种病原微生物的质谱鉴定试验，包括样品采集和制备，整个过程不到10 min，在感染性疾病的病原学快速诊断方面发挥了重要作用。

MALDI-TOF-MS技术虽然在微生物的鉴定上具有快速、简单、成本低等优点，但该方法也存在一定的局限性。其准确鉴定依赖于完善的数据库，如数据库无待测菌谱图，将无法得到鉴定结果；另一方面，MALDI-TOF-MS技术应于微生物鉴定是检测细胞内核糖体蛋白图谱，当核糖体蛋白图谱相同时则无法鉴别；此外，有些微生物细胞壁的结构不同，需要个体化提取核糖体蛋白，蛋白提取成功与否，也决定能否准确进行鉴定。MALDI-TOF-MS技术鉴定微生物必须是可培养微生物，直接标本鉴定应用于临床尚有待于进一步深入开发研究。

1.3 下一代测序技术

随着人类基因组计划在2003年彻底完成，基因测序技术不断发展，下一代测序(next generation sequencing, NGS)技术逐步成为主流测序技术。NGS又称高通量测序，包括二代大规模平行测序和三代大分子测序。二代测序原理：将基因组DNA随机切割成小片段DNA，在通过构建文库、PCR扩增等技术流程获得测序模板进行测序及数据分析，相对于Sanger测序通量高、速度快、费用低，但普遍存在读长较短的缺点。三代测序原理：不需要进行PCR扩增，通过不同手段区分碱基信号差异，直接读取序列信息，其读长长、通量高，可以对RNA和甲基化DNA序列进行直接测序，但目前还存在错误率高、成本较高和生物信息分析软件不够丰富等缺点[15- 16]。

近年来，随着全球感染性疾病谱的变化，疑难感染不断增多，并非所有病原体均能在诊断实验室中成功培养出来，而病原学分子诊断提供信息有限，NGS技术不依赖培养技术，直接检测临床样本 (血液、脑脊液、肺泡灌洗液等)，应用NGS技术和生物信息分析软件可快速全面鉴定细菌、病毒、真菌、寄生虫，为疑难危重感染提供快速精准诊断依据，指导抗菌药物的合理应用成为优势。NGS在时间上与细菌培养所需时间相当，能检测到不被培养的细菌并进行菌种鉴定，确定细菌种类的分类基因组学[17]并可提供关于此细菌致病潜力的直接信息，通常对于作出准确的临床决策至关重要。随着成本降低，高通量测序有望在临床广泛应用。

目前，NGS技术常规应用于临床病原学检测仍存在很多实际问题：(1)病原体鉴定的准确度很大程度取决于分析的参考数据库的范围和完整性；(2)临床标本的复杂性，可能使病原体信息太少而导致数据丢失或病原体数据混杂在正常菌群中难以区分；(3)NGS测序数据的解读至关重要，测序的长度、数量、质量以及试剂可能的细菌污染，均可影响病原体识别，导致标本中细菌多样性估计过高；(4)目前尚未建立不同标本测序前处理和参数设置的统一规定，微生物NGS测序质量评估、质量控制体系亦尚在建立中，美国食品药品监督管理局尚未批准临床微生物NGS测试[18- 19]。

2 病原学诊断新技术临床应用策略

2.1 基于循证检验医学，全面了解病原学诊断新技术的检验效能

目前各种新型诊断技术平台层出不穷,基于上述技术的平台诊断产品正不断被探索和应用于临床，临床诊断正向着更快捷、准确、经济的方向发展，因此各种新型诊断技术平台的临床应用问题显得尤为重要。现实是，制造商热情提供试剂，临床医生和检验人员欣然接受，许多新的检验项目在检验效能未被充分了解之前，即已被积极推向临床，其应用效果通常是在信息不完整的情况下由临床医生各自得出的。例如，半乳糖甘露聚糖(galactomannan，GM)试验在2008年版《曲霉菌病诊治指南》中被建议用于高风险患者的筛查， 而2016年版《曲霉菌病诊治指南》[20]指出，对于血液系统恶性肿瘤及造血干细胞移植患者，建议将血清和肺泡灌洗液中的GM作为侵袭性曲霉病的精确诊断标志物，属于高级别证据推荐意见。同时，必须认识到此推荐意见的适用人群具有一定范围，且精确诊断标志物和确诊标志物并不等同，不应过分强调GM试验的价值。过去几年中，GM试验实际被广泛应用于非血液系统恶性肿瘤及造血干细胞移植患者，造成检测结果与诊断预期不符，试验结果受到质疑。经过循证医学研究确定了GM试验的应用范围，体现了感染性疾病诊疗的精细化。

循证检验医学是依据循证医学“以当前最佳证据为基础”的原则，规范检验医学的研究、设计和文献评价，目的是向临床提供有效检验证据、最有利于医患双方诊断试验的诊断效能、成本-效果分析等信息。Neal等[21]提出了评估任何诊断性试验效能的主要步骤：(1)该试验能否可靠进行？确定该试验的准确度、精密度和依赖于使用者的程度。(2)是否在合适的人群中对该试验进行了评估?试验数据是从哪一部分人中得出的？(3)是否使用了合适的参考标准？(4)是否选择了合适的临界值来优化敏感度和特异度？理想的试验能够使敏感度和特异度最大化，从而使假阳性率和假阴性率最小化。(5)阳性和阴性似然比是多少？阳性似然比越高越好，阴性似然比越低越好。(6)该试验在特定人群中的检验效能、阳性预测值和阴性预测值分别是多少？(7)疾病成本与试验成本之间的平衡如何？

当新型诊断技术应用于临床时，检验人员有责任和义务通过循证医学手段获得新诊断技术的检验效能，即灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性和阴性似然比及该试验适用的特定人群等，以帮助临床医生更合理地选择试验，正确解读报告。此项工作也将随着临床研究的进展而逐步更新。

2.2 临床医生应重视临床经验、微生物学特点、流行病学和最佳诊断证据有机的结合

在现代医学快速发展的今天，许多临床医生往往过于重视新技术的掌握，却忽视了临床基本功的价值。临床医生日积月累的临床经验是非常宝贵的，感染性疾病的循证医学在强调医生临床经验的同时，也强调临床医生必须掌握寻找证据、评估证据、应用证据的技能。在应用灵敏度和特异度均很高的诊断试验技术时，还要注意其应用的特定人群,在高危人群中进行筛查可获得较高的阳性预测值，最佳证据也要应用于合适的人群才能达到最佳效果。例如，血清和肺泡灌洗液中的GM可作为血液系统恶性肿瘤及造血干细胞移植患者中侵袭性曲霉病的精确诊断标志物，而不建议作为实体器官移植受者或慢性肉芽肿病患者筛查项目(强力推荐，证据级别高)[20]。因此把临床经验、病原微生物的特点、流行病学与最佳诊断证据多方面信息有机结合，才能得到科学的临床决策。

3 结语

由于感染性疾病具有宿主易感性、感染部位及致病微生物复杂多变等诸多特性，临床微生物实验室已从过去强调技术的先进性和前沿性，转变为从循证医学角度关注技术如何为临床提供最佳证据。临床医生则需将感染性疾病的临床表现、病原微生物特点、流行病学特点及最佳诊断证据等多方面信息有机结合，制定更加准确的治疗方案，以实现感染性疾病的精准治疗。