米非司酮对人子宫内膜细胞凋亡及促血管生成因子表达的影响

李秋芳

[摘要]目的为了解米非司酮对子宫内膜细胞的毒性，探讨使用米非司酮后子宫内膜细胞凋亡情况以及促血管生成因子水平变化情况。方法取培养的人子宫内膜细胞，观察不同浓度米非司酮的细胞毒性情况，以染色流式细胞术检查细胞凋亡的全科，同时使用实时荧光定量聚合酶链反应观察米非司酮对促血管生成因子水平的影響。结果发现随着药物浓度上升，细胞死亡率增加、细胞解体、排列紊乱现象严重；米非司酮对基因pro-Caspase3表达有抑制作用，药物对Ang-1表达有抑制效果，对VEGF、Ang-2表达有促进效果。结论米非司酮可能通过调控pro-Caspase3表达促进人子宫内膜细胞凋亡有效果，同时此药抑制机体Ang-1表达、增加VEGF、Ang-2表达。

[关键词]子宫内膜；促血管生成因子；米非司酮；细胞凋亡

[中图分类号]R711.52 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2017）17-33-04

米非司酮是临床围绝经期功血常用治疗药物，功血发病与神经系统和内分泌系统功能失调有关，而米非司酮能增加机体内孕酮水平、抑制子宫内膜增生，从而有效控制出血，临床实践发现若连续用药3个月以上，易造成闭经情况。有学者认为造成闭经现象发生与米非司酮促细胞凋亡有关，但目前临床对这方面研究较少，故本文观察米非司酮对子宫内膜细胞凋亡、促血管生成因子表达的影响，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

实验试剂：实时定量PCR试剂盒（Takara）、Caspase3抗体（Cell Signaling）、米非司酮（Sigma），DMEM/F12培养基，人子宫内膜细胞（中科院实验室）。

细胞培养：将细胞放于含有10%胎牛血清的培养基中，后将培养基置于保温箱中培养，条件设置为温度37℃、饱和湿度、二氧化碳体积分数为5%，以不同浓度（5、10、15μg/mL）米非司酮对细胞进行处理，在细胞培养48h后用电学显微镜观察细胞生长情况。

1.2方法

1.2.1实时定量PCR检测 将经15μg/mL米非司酮处理的子宫内膜细胞培养2d后，使用realtime-PCR检测细胞内促血管生成因子VEGF、Ang-2、Ang-1表达量，本次检测严格按照说明书对细胞进行裂解并提取RNA，后将RNA逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，最后使用PCR仪对PCR扩增，参数为94℃2min，94℃20s，50℃-60℃20s，60℃40s，如此重复40次，读取Ct值，计算出相对表达量，检测重复3次，取平均值。

1.2.2细胞凋亡检测 将细胞以不同浓度米非司酮药物进行处理，后经消化、离心以流式细胞仪以及试剂盒（AnnexinV-FITC/PI），检测子宫内膜细胞凋亡情况，判断标准：早期凋亡结果为Annexin V⁺/PI一，晚期死亡为Annexin V⁺/PI⁺，总凋亡率为两种凋亡率之和。 1.2.3细胞凋亡基因Caspase3蛋白表达检测 以15μg/mL米非司酮处理细胞，并培养2d，后裂解取细胞蛋白，为计算蛋白浓度使用BCA法，绘制稀释后蛋白浓度曲线，以10%聚丙烯酰胺凝胶对等量蛋白样品进行电泳分离，并转印至PVDF膜上。加入封闭液封闭2h环境条件为室温，2h后加入兔抗人β-actin稀释液、一抗Caspase3稀释液，在4℃温度下孵育过夜。用PBST冲洗3次，后加入有HRP标记的羊抗兔二抗稀释液（按1：7500），室温孵育1小时，再以PBST洗3次，加入电化学发光底物，使用成像仪拍照，本次使用的PBST为PBS溶液加上Tween-20。

1.3观察指标

观察不同浓度米非司酮刺激下子宫内膜细胞生长情况以及凋亡情况，同时检测药物对细胞内促血管生成因子水平变化的影响，同时观察细胞凋亡因子pro-Caspase3以米非司酮处理后表达情况。

2结果

2.1细胞在以不同浓度米非司酮刺激后生长情况

药物剂量越大细胞解体、排列紊乱现象越严重，见图1。

2.2药物对细胞凋亡基因pro-Caspase3表达的影响

米非司酮对基因pro-Caspase3表达有抑制作用，见图2。

2.3子宫内膜细胞凋亡与不同浓度药物的相关性

对照组细胞凋亡率为（3.27±0.35）%，经5、10、15μg/mL米非司酮处理后，细胞凋亡率分别为（10.42±0.84）%、（12.67±1.32）%、（18.75±1.53）%，结果表明药物浓度约大细胞凋亡率越高，见图3。

2.4米非司酮对促血管生成因子表达的影响

药物对Ang-1表达有抑制效果，对VEGF、Ang-2表达有促进效果，见图4。

3讨论

米非司酮是临床强效抗孕激素的药物，多用于催经止孕、功血、抗早孕、死胎引产以及宫内节育器取出、刮宫术等治疗中，其不仅能抑制子宫内膜增生、分化，还对内膜退化、凋亡有促进作用，同时对绒毛、蜕膜组织有破坏效果，能降低机体血孕酮水平，使黄体萎缩、前列腺素释放。但目前临床对药物治疗作用机制尚未完全了解，本次通过观察内膜细胞经米非司酮刺激后生长、凋亡情况以及相关因子水平表达情况，来分析药物作用。

本次观察不同浓度药物处理后细胞生长、凋亡情况，发现随着药物浓度上升，细胞死亡率增加。有研究表明子宫内膜增生与子宫内膜细胞凋亡有密切关系，细胞凋亡不足会使细胞增殖失控，导致增生，子宫内膜过度增生会引发围绝经期子宫出血，而过度凋亡则会引发萎缩症，本次研究显示米非司酮药物浓度增加有促细胞凋亡效果，提示此药可能通过加速内膜细胞凋亡，从而产生抑制内膜增生作用，进而达到治疗目的。同时在药物处理细胞48h后，观察细胞生长情况，发现内膜细胞数量减少且细胞形态出现明显改变。结果提示米非司酮对细胞毒性与给药时间长短、用药剂量多少有关，大剂量使用药物会造成细胞出现解体、排列紊乱等情况，因此临床在用药时为避免毒性增强，需要避免长时间、大剂量用药。Ang-1、Ang-2为血管生成调节因子，其中前者能与内皮细胞中Tie-2受体结合，使受体磷酸化，从而产生抑制细胞凋亡的效果，而后者能抑制前者功能，使血管重构，VEGF能与Ang-2产生协同作用促进新血管生成。本次研究结果显示使用药物后Ang-1表达降低、VEGF、Ang-2水平上升，结果提示米非司酮通过提高内皮细胞内VEGF、Ang-2水平，从而促进血管生成，改善患者功血症状。同时本次研究发现15μg/mL米非司酮处理细胞后48h，pro-Caspase3表达量明显较对照组降低，Caspase3为执行细胞凋亡的效应蛋白，有研究表面pro-Caspase3表达量与细胞凋亡率呈负相关性，本次研究结果提示米非司酮可能通过调控pro-Caspase3表达，来促进细胞凋亡，以抑制子宫内膜增生，改善患者功血情况。

综上所述，米非司酮对人子宫内膜细胞凋亡有促进效果，其可能通过调控pro-Caspase3表达，达到促细胞凋亡的目的，同时此药抑制机体Ang-1表达、增加VEGF、Ang-2表达，能促进血管生成。

（收稿日期：2017-05-09）