羟基喜树碱对甲状腺相关眼病球后成纤维细胞增殖和凋亡的影响

彭细峰　邓江涛　叶静梅　姜文浩

[摘要]目的观察羟基喜树碱对体外培养的球后成纤维细胞增殖和凋亡的影响。方法甲状腺相关眼病患者球后成纤维细胞体外培养。免疫组织化学染色检测波形蛋白在球后成纤维细胞中的表达。将不同浓度的HCPT（1、5、10、50、100mg/L组）作用于球后成纤维细胞48h，用MTT法检测各组药物对细胞增生的抑制率。流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。提取细胞内总蛋白、采用Western blotting法检测活化型caspase-3和caspase-3、bax和bcl-2、p-JNK和JNK、p-AKT和Akt在HCPT中的表达。结果MTF法显示不同浓度的HCPT（1、5、10、50、100mg/L组）能降低成纤维细胞细胞的A值（P<0.05），细胞生长抑制率随药物浓度的增加而增加。流式细胞仪检测凋亡率随着浓度的增加而增高；Western blotting法检测结果证明，活化型caspase-3、bax、p-JNK表达的灰度值明显增加，差异均有统计学意义。结论羟基喜树碱能诱导体外培养球后成纤维细胞，其作用呈剂量依赖性。

[关键词]羟基喜树碱；甲状腺相关眼病；球后成纤维细胞；凋亡

[中图分类号]R771.3 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2017）17-26-04

甲状腺相关眼病（thyroid associated ophthalmopathy，TAO）发病率居眼眶疾病之首。它的发病机制目前还不完全清晰，研究表明TAO是一种自身免疫或器官免疫性疾病。球后成纤维细胞（retroocularfibroblasts，RF）在TAO发病中起至关重要作用。因此，怎样抑制球后成纤维细胞的增生，找到最佳的治疗方法是目前临床上急需要解决的问题。有实验证实，羟基喜树碱（hvdroxycamptothecin，HcPT）可以对抗肿瘤，而且可以对抗纤维化。本实验研究羟基喜树碱对体外培养的TAO患者球后成纤维细胞增殖、凋亡的影响，并从细胞传导通路的途径探讨羟基喜树碱对球后成纤维细胞可能作用机制。

1材料与方法

1.1一般材料

眼眶脂肪组织5例来自于2016在深圳市龙岗中心医院行眼眶减压手术的TAO患者，他们均为静止期患者，其中男3例，女2例。5例手术患者都符合TAO的诊断标准，且排除了其他自身免疫性疾病和肿瘤相关性疾病等。5例患者术前均已经签署知情同意书。手术时期的甲状腺功能正常达半年。羟基喜树碱（纯度≥99%，成都兰贝植化有限公司，批号100903）；鼠抗人波形蛋白抗体、羊抗鼠Cy3荧光抗体（sc-166894，Sigma，美国）；CCK-8试剂盒（Promega，美国）；兔抗人caspase-3抗体，ab71481），兔抗人活化型caspase-3抗体，ab32042）、兔抗人bax抗体（ab32503）、兔抗人bcl-2抗体（ab2123）、鼠抗人B-actin抗体（ab6276）（Abcam，英国）、兔抗人JNK抗体（9258）、兔抗人p-JNK抗体（4668）（CST，美国）、羊抗鼠二抗（sc2058）、羊抗兔二抗（sc2007）（Santa，美国）、ECL显影液（Millipore，美国）、台式离心机、流式细胞仪（BD FACSCalibur，美国）。

1.2方法

1.2.1球后纤维细胞的培养和鉴定 手术中取出的眼眶组织放入培养瓶。用组织块法培养原代细胞，选其中的第2代到第6代细胞进行实验。免疫组织化学染色鉴定：对数生长期的细胞接种到培养皿，待细胞长至半满后，将玻片取出，免疫组化染色制片。一抗用兔抗人波形蛋白单克隆抗体，二抗用生物素化羊抗兔IgG。

1.2.2对细胞生长影响的检测 （1）空白对照组：加单细胞悬液和与药物处理组相同体积DMSO溶剂，不加其他药物，使DMSO在培养液中的浓度保持在≤1%；（2）药物处理组：细胞悬液中加入5种不同质量浓度的HCPT，使它的终浓度为1、5、10、50、100mg/L。将1×10⁴个/mL的成纤维细胞接种于96孔板，每孔200μL体积，第1孔加和药物处理组等同体积的培养液，不加细胞及任何药物，设定为空白空白对照组孔。空白对照组设置4个重复孔，各药物处理组设置4个重复孔。培养48h后每孔加入MTT溶液，37℃培养4h后去除上清液，每孔分别加入150μL DMSO，震荡10min后等待结晶溶解。空白孔设为零，用酶联免疫检测仪测490nm波长的光吸收值。计算各组的细胞生长抑制率，求平均值。细胞生长抑制率（%）=（空白对照组A490-药物处理组A490）/空白对照组A490×100%。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率 将4×10⁴/mL细胞接种于培养瓶，每瓶5mL（2×10⁵细胞），总共18瓶（每浓度3瓶）。空白对照组为RPM11640培养的成纤维细胞，药物处理组加入不同质量浓度的HCPT（1、5、10、50、100mg/L），培养48h，收集于离心管，1000rpm离心5min后，PBS洗涤2次，70%的乙醇进行固定，4℃以下过夜。PI染色，流式细胞仪进行检测。

1.2.4Western blot法检测 caspase-3、活化型caspase-3、bax、bcl-2、p-JNK、JNK、p-AKT和Akt在HPCT中的表达 取空白对照组、1、5、10、50、100mg/L HCPT组处理48h的细胞，倒出培养液，预冷PBS洗3遍。加入含有100mmol/L PMSF裂解液400μL，冰上裂解30min。离心半径4cm，4℃ 12000dmin离心5min后，去除上清液后用BCA法进行测定，调至等质量浓度。按顺序行质量分数10%SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF进行转膜，质量分数5%的脱脂牛奶予以封闭2h，4℃封闭，一抗过夜，TBST进行清洗3次后曝光显影，采用计算机软件分析灰度值并記录，以目的蛋白/β-actin进行灰度值校正，计算各组灰度值比例，再计算出活化型caspase-3/caspase-3、bax/bcl-2、p-JNK/JNK、p-AKT/Akt的比例，以百分数表示。

1.3统计学处理

本研究采用SPSS14.0统计软件进行数据统计与分析。计量资料以（x±s）表示，各组数据采用重复测量的方差分析，各药物处理组与空白对照组比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1球后成纤维细胞免疫组化鉴定

SP法染色体外培养的球后成纤维细胞见波形蛋白表达阳性，位于胞浆，与成纤维细胞长轴方向一致的网状结构和棕黄色束状结构；细胞角蛋白表达阴性。

2.2MTT检测HCPT对RF增殖的作用

不同浓度HCPT干预成纤维细胞48h后，MTT法检测细胞的吸光值（A值）及计算出的平均细胞生长抑制率分别见表1。药物处理组与对照组细胞A值的差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3不同浓度HCPT作用后RF的凋亡情况

空白对照组细胞的凋亡率（0A3±0.16）%，各药物浓度作用下成纤维细胞凋亡率均比空白对照组凋亡率高，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4活化型caspase-3/caspase-3、bax/bd-2、p-JNK/JNK、p-AKT/AKT在不同药物处理组RF中的表达变化

Western blot法检测结果表明，活化型caspase-3、bax、p-JNK在空白对照组RF中仅有少量表达，在HCPT处理组中的表达明显多于空白对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。Bcl-2、p-AKT在空白对照组RF中的表达量最高，在HCPT处理组中的表达随着浓度的增加表达量下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。不同浓度HCPT干预球后成纤维细胞48h后，采用重复测量方差分析，细胞的活化型caspase-3/caspase-3、bax/bcl-2、p-JNK/JNK、p-AKT/Akt的比例值差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表3。

3讨论

甲状腺相关眼病又称Graves眼病，内分泌突眼。国内外对甲状腺相关眼病的研究呈上升的趋势。由于发病机制尚不明晰，各种治疗方法的效果都不是特别理想。成纤维细胞的增殖在多种眼病中担任着重要角色，例如增殖性玻璃体视网膜病变、青光眼手术后疤痕组织增生、翼状胬肉的发生发展及复发等。有研究证实，球后成纤维细胞既是TAO发展中的靶细胞，同时也是效应细胞，参与及完成了多个免疫反应。临床围绕抗纤维化，试验了5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、环孢霉素A、全反式维甲酸、秋水仙碱等多种药物，可这些药物的毒性作用、副作用都比较大，因此在临床使用比较局限。羟基喜树碱是从珙桐科植物喜树中提取出来的一种生物碱，刚开始用于抗肿瘤，有毒、副作用偏小、水溶性好、患者易耐受等特点，它主要通过抑制细胞增生、诱导凋亡、影响细胞周期等机制发挥作用，在非肿瘤性疾病等方面也发挥了重要作用。已有研究证实羟基喜树碱可以抗纤维增生。但对体外培养的TAO患者球后成纤维细胞的增殖是否有影响还没有见研究报道。我们采用体外培养细胞的方法，观察HCPT对球后成纤维细胞增殖的影响，发现1、5、10、50、100mg/L HCPT作用于球后成纤维细胞48h后，能抑制TAO患者球后成纤维细胞的增殖；而且随着药物浓度增加，MTT法所测得的吸光值降低，抑制率增高；提示HCPT是呈剂量依赖性的方式抑制球后成纤维细胞的增殖。研究的结果和其他学者研究的结果是一致的。因此我们推测当较高浓度的HCPT作用于球后成纖维细胞时，有可能诱导了球后成纤维细胞的凋亡。

在HCPT处理体外培养的RF通过什么样的途径诱导凋亡？本实验从细胞信号传导通路方面进行了研究。正常组织的代谢需要组织增殖和凋亡维持平衡才能进行。多种调节细胞增殖与凋亡的基因/蛋白参与了球后成纤维细胞增殖。与细胞凋亡密切相关的基因有Bcl-2和Bax蛋白，Bcl-2基因是一个长寿基因，Bcl-2基因位于第18号染色体，Bcl-2蛋白在介导细胞凋亡途径中起着非常关键的作用，通过调控内质网中的钙离子参与的物质转运以及膜通透性转换从而阻止细胞色素C从线粒体中释放出来，达到阻止细胞凋亡的反应，它主要通过抵抗细胞的死亡延长细胞的寿命，从而引起细胞的数目增多，即是抑制细胞凋亡。Bax基因促进细胞的凋亡。两者的比例决定了细胞的凋亡。Bcl-2先要与Bax结合成二聚体才可以抑制细胞的凋亡。Bcl水平降低则不能平衡Bax的作用，引起细胞发生凋亡，反之则导致细胞的增殖。有实验证明，HCPT能诱导细胞凋亡，机制可能与下调Bcl-2基因表达有关。本实验采用流式细胞检测仪测到不同质量浓度的HPCT处理球后成纤维细胞48小时后，胞内Bcl-2蛋白的表达水平与空白对照组比较有降低，提示可以降低Bcl-2的表达水平是HPCT诱导成纤维细胞细胞凋亡的机制之一。Caspase-3是细胞凋亡激活中重要的蛋白，它在细胞凋亡的过程中起着最后执行作用。它平常以无活性的前体形式存于细胞中，当细胞受到某些凋亡信号刺激时，caspase-3随即可裂解为活化型的caspase-3，并且通过酶切特异性底物拆散细胞骨架，组织DNA的修复，干扰信使核糖核酸的剪切，从而诱导细胞凋亡。JNK是信号蛋白，其通过磷酸化而激活发挥生物效应。P-JNK可以下调bcl-2，c-IAPI通过线粒体途径诱导细胞的凋亡。AKT磷酸化激活可以促进细胞增生，抑制细胞凋亡，本研究结果显示，p-AKT的表达量随着HCPT浓度的增加反而降低，提示AKT保护作用的减弱是本实验促进细胞凋亡的很重要的因素。

本实验研究结果表明，HCPT能抑制球后成纤维细胞增殖，可以诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性，提示HCPT在治疗TAO方面有良好前景，为今后TAO临床研究提供了新的思路和方向。目前的研究仅局限于离体的实验，体内的试验效果如何，有待进一步研究。

（收稿日期：2017-05-02]