Iss融合蛋白的免疫预防潜力分析

樊 琛，曾庆华，王 雷，郭兴峰，孙小凡，郑焕芹

(聊城大学农学院，山东聊城 252059)

某些大肠埃希菌(Escherichiacoli)的致病菌株可引起人畜共患的细菌性传染病，病型复杂，这些传染病中危害最大的是急性败血型。大肠埃希菌的毒力是由多种毒力因子共同作用的，包括黏附素、1型菌毛、毒素、外膜蛋白、ColV质粒、补体抗性、铁转运系统、宿主细胞表面改变因子等[1-4]。在败血型大肠杆菌病中，菌体必须具备抵抗血清抑菌作用和杀菌作用的能力，并能够在宿主血液环境中增殖。iss基因编码的外膜蛋白可以调节细菌表面对补体敏感的位点，导致细菌表面排斥补体，使菌体具有抵抗宿主血清中补体溶菌作用的能力[5-7]。动物血液中，游离铁浓度极低，不利于细菌增殖，因此菌体需要具备获得铁的能力才能够在宿主血液中增殖。ybtA基因及chuA基因被认为与鸡致病性大肠埃希菌(APEC)的铁采集系统有关[8-13]。iss基因由于其序列的高保守性，被认为具有亚单位疫苗的潜力。近年来，多项研究致力于将Iss蛋白研发为亚单位疫苗[14-16]，但其保护机理不明。Iss蛋白免疫动物是否也能对败血型大肠埃希菌其他毒力因子(如ybtA基因、chuA基因编码产物)发挥抑制作用尚无相关研究数据。作为单一毒力因子，Iss蛋白能否起到广泛的免疫保护作用而应用于商业生产也缺乏试验依据。目前尚无Iss亚单位疫苗在生产实际中应用的报道。因此仅采用Iss蛋白这一单一毒力因子制备亚单位疫苗是否具有实际应用潜力，还需要更多的试验数据来支持。本研究采用Iss融合蛋白免疫14日龄雏鸡，分别进行动物试验和体外血清抗性试验，并比较免疫后的动物血清对iss基因、ybtA基因及chuA基因转录的影响，分析Iss融合蛋白在鸡大肠杆菌病免疫预防中的应用潜力及不足之处，以期为Iss蛋白作为亚单位疫苗的研究积累数据资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鸡大肠埃希菌HO2株分离自黑龙江某发病鸡场，经中国兽医药品监察所鉴定为强毒株，血清型为O2，由东北农业大学预防兽医教研室保存，于170 mL/L甘油中-70 ℃冷冻保存[5]；CVCC1553购自中国兽医药品监察所，血清型O78，其iss基因序列与HO2菌株的一致。经实验室早前雏鸡致死试验、鸡胚致死试验、血清抗性试验检测，2株菌雏鸡致死率均为100%、鸡胚致死率均为70%，确定2株菌为强致病性血清抗性菌株[17]。

1.1.2 试剂 LB肉汤、麦康凯琼脂，青岛高科技园海博生物技术有限公司产品；SDS-PAGE蛋白电泳试剂盒和胶回收试剂盒，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司产品产品；兔抗鸡IgY H&L (HRP) ，Abcam公司产品产品；TMB染色液，Beyotime Biotechnology公司产品产品；脱脂奶粉，伊利乳业有限责任公司产品产品；RNA酶抑制剂及dNTP Mixture，TaKaRa公司产品产品；细胞细菌总RNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品产品；SYBR○RGreen Realtime PCR Master Mix、反转录酶，东洋纺(上海)生物科技有限公司产品；纯化的Iss融合蛋白为聊城大学食品安全实验室前期制备，切胶纯化产物。

1.1.3 试验用动物 1日龄雏鸡，购自聊城阳谷养鸡场，饲养至14日龄进行试验。

1.2 方法

1.2.1 抗血清的制备 纯化的Iss融合蛋白0.100 mg与等量弗氏佐剂乳化。14日龄雏鸡分2组，分别为对照组和免疫组。每组10只，每隔1周肌肉注射免疫1次，四免后5 d，采血分离血清，于-20℃保存备用。对照组仅注射佐剂。血清临用前56℃、30 min灭活补体[1,2,8]。

1.2.2 动物体内试验 每株待测菌中，14日龄雏鸡分3组，分别为空白组、对照组和试验组。 先按照1.2.1方法免疫，四免后7 d进行攻毒试验。攻毒试验时，将待测细菌于LB液体培养基中37℃摇床过夜培养，培养物用PBS洗2次，并用PBS悬浮。每只雏鸡肌肉注射0.2 mL菌液(约109CFU)，每组10只。空白组不免疫不攻毒，对照组仅注射佐剂并攻毒，试验组免疫并攻毒。连续观察7 d，记录死亡和发病情况[15-16]。

1.2.3 抗血清效价检测 纯化的融合蛋白用包被液稀释至10 μg/mL，每孔100 μL。待检血清倍比稀释，二抗1∶5 000稀释。采用常规间接ELISA检测抗体效价[1,5]。

1.2.4 间接ELISA 新鲜培养的菌体以全菌体的方式用包被液稀释至108个/mL，每孔100 μL。抗血清1∶100稀释，二抗1∶5 000稀释。反应时间、温度等条件与常规间接ELISA相同，TMB显色[1,5]。

1.2.5 凝集试验 用生理盐水按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀释抗血清，加入等量1×109个/mL的菌液，观察是否有凝集现象。

1.2.6 抗Iss血清对菌株血清抗性抑制作用的检测 按1∶100接待测菌于LB中，并分别按1∶100加入56℃ 30 min灭活的Iss蛋白抗血清及阴性对照血清，于37℃培养至对数期。取1 mL对数期菌液于8 000 r/min离心5 min，0.6 mol/L NaCl溶液洗2次。9 g/L生理盐水重悬混匀，倍比稀释至106CFU/mL。取0.1 mL菌液加入0.5 mL生理盐水、0.4 mL新鲜鸡血清混合，混合物于37℃温育。分别于0、2 h取样涂板，37℃培养18 h后平板计数，记录菌落数[1,3]。按下式计算：

试验组： Δlg=lg(2 h)-lg(0 h)

对照组： Δlg=lg(2 h)-lg(0 h)

抑制作用：ΔΔlg=Δlg(试验组)-Δlg(对照组)

同时于0、2 h取样，采用实时荧光定量PCR检测相关基因mRNA的表达水平。

1.2.7 实时荧光定量PCR RNA提取及反转录按试剂盒说明书和实验室常规方法进行；real-time PCR中，扩增相应目的片段的引物序列为：iss基因上游引物5′-GCCGCTCTGGCAATGCTTATTACA-3′，下游引物5′-TCCTTTGGTGTTACTGCTGTCGGT-3′；ybtA基因上游引物5′-CCGATTCGAGAGCATTACCC-3′，下游引物5′-CAACAGCAGTGGGAGTCGAT-3′；chuA上游引物5′-CAGATAACAAAAGGAGCAAGGC-3′，下游引物5′-CTGACGATAATACTCACCGCC-3′；GAPDH基因上游引物5′-CATCGTTTCCAACGCTTCCT-3′，下游引物5′-ACCTTCGATGATGCCGAAGTT-3′。反应条件95℃ 3 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，39个循环。结果用△Ct表示[13]。

2 结果

2.1 体内攻毒试验结果

雏鸡肌肉注射细菌后，注射CVCC1553及HO2菌株的试验组和对照组鸡只均出现腹泻症状，注射CVCC1553的组在观察期间无死亡，注射HO2的组在观察期间试验组和对照组各死亡1只；空白组未出现腹泻症状及死亡(表1)。剩余鸡只采血检测血液中细菌含量，结果显示,仅HO2菌株攻毒的对照组和试验组血样中检出大肠埃希菌，且对照组和试验组的活菌数相近，均为3 CFU/10 mL～4 CFU/10 mL；CVCC1553菌株攻毒的对照组和试验组血样中均未检出大肠埃希菌。表明Iss融合蛋白免疫14日龄雏鸡未产生明显的保护作用。

2.2 抗血清对菌株血清抗性抑制体外试验结果

待测菌株分别于抗血清及阴性对照血清中温育后，再与新鲜鸡血清混合。HO2菌株的抗血清组及阴性血清组的菌体与新鲜血清混合0 h的活菌数相近， 2 h后两组活菌数差异明显，抗血清组活菌数明显低于阴性血清组的。而CVCC1553菌株的抗血清组及阴性血清组与新鲜血清混合0、2 h的活菌数均相近，结果用△△lg表示(表1)。

本试验中，平板计数的误差通常≤0.200。采用95%置信区间分析，上限为0.176，下限为-0.158。HO2菌株的△△lg明显小于下限(-0.158)，可认为抗血清组及阴性血清组菌体在加入新鲜血清培养2 h后的活菌数有明显差异，即抗血清组菌体的血清抗性受到抑制。CVCC1553菌株的△△lg大于下限，小于上限，表明抗血清未对菌体的血清抗性产生抑制。

表1 体外血清抗性抑制试验及体内攻毒试验结果

2.3 间接ELISA及凝集试验结果

经间接ELISA检测，抗血清的效价为1∶100。采用全菌体包被ELISA检测时，抗血清及阴性血清的待测样孔ΔOD 492 nm<0.050，P/N<2.1，皆为阴性。在凝集试验中，各稀释浓度均未出现凝集现象。说明融合蛋白免疫雏鸡产生了相应的抗体，但抗体效价较低。全菌体包被间接ELISA及凝集试验皆为阴性，表明抗血清与全菌体直接结合的作用较弱。

2.4 实时荧光定量PCR结果

抗血清组及阴性对照血清组培养至对数期的菌体，与新鲜血清混合后分别于0、2 h取样，采用实时荧光定量PCR检测iss、ybtA及chuA基因的mRNA转录水平，看家基因为GAPDH，结果用△Ct表示(表2)。

表2 实时荧光定量PCR检测结果

△Ct越大则样本拷贝数越小。由表2可知，HO2菌株iss、ybtA及chuA基因的△△Ct0 h>0，即0 h时抗血清组△Ct0 h均大于阴性血清组，抗血清组的iss、ybtA及chuA基因mRNA拷贝数低于阴性血清组。表明HO2菌株与抗血清培养后，抗血清对其iss、ybtA及chuA基因mRNA的转录水平均产生抑制。CVCC1553菌株iss、ybtA及chuA基因△△Ct0 h<0或接近0，显示抗血清对CVCC1553菌株这些基因的转录未产生明显的抑制作用。这与体外血清抗性抑制试验结果一致。提示Iss抗血清可能通过抑制iss等相关基因的转录，降低毒力因子的表达，从而抑制菌株的血清抗性。但其抑制作用在不同菌株中的效果差异较大。

3 讨论

血清对大肠埃希菌的抑菌作用和杀菌作用可能受到荚膜抗原、脂多糖和特定外膜蛋白等因素影响。抑制菌株的血清抗性或/和降低菌株在血液中的增殖，可减缓大肠杆菌病的进程，尤其是减少败血症的发生。iss基因编码的外膜蛋白可以通过调节细胞表面上对补体复合体敏感的位点，导致细胞表面排斥补体，使菌体具有抗血清补体溶菌能力[5-7]。体外试验中，仅HO2菌株的血清抗性被抗血清抑制。在添加补体之前，抗血清和阴性血清组的活菌数无显著差异；但添加补体后，活菌数出现明显差异。说明抗体并没有直接杀死细菌，也不抑制其增殖。推测，抗血清是通过减少Iss蛋白在菌体表面的表达导致菌体血清抗性下降，进而有利于补体发挥杀菌作用，因此在加入含补体的新鲜血清后，抗血清组的活菌数明显下降。采用间接ELISA及凝集试验分析菌株与抗血清的结合程度，结果全菌体包被的间接ELISA和凝集反应均为阴性，表明抗体与全菌体的直接结合反应较弱；也说明抗血清直接与菌体结合并导致菌体死亡或增殖抑制的可能性较低。由于Iss蛋白锚定在细胞膜上，而不是游离在细胞质中，即使采用超声裂解等手段，也不能确定所有Iss蛋白均完全暴露，因此不利于间接ELISA的定量分析，仅适于定性分析。ybtA基因及chuA基因的表达产物被认为与鸡致病性大肠埃希菌的铁采集系统有关，可调节菌体在血清中的铁获得能力，有利于菌体在血清中的增殖[8-12]。实时荧光定量PCR检测基因的mRNA表达显示，抗血清对HO2菌株iss、ybtA及chuA基因的mRNA转录水平产生抑制，但对CVCC1553菌株此3种基因的mRNA转录未产生明显抑制，此结果与血清抗性抑制试验结果一致。结合实时荧光定量PCR、ELISA、凝集试验及血清抗性试验结果，推测菌体在增殖分裂过程中受到抗血清的影响，抑制了基因的转录，使菌体对血清环境敏感性提高。但Iss抗血清的抑制作用在不同菌株间的差异较大，本试验中的2株菌iss基因序列相同、血清型不同，Iss抗血清对菌株血清抗性的抑制作用与iss基因序列及血清型的关系还需要采用更多试验样本进行探讨。

虽然Iss抗血清在体外试验中表现出对HO2菌株血清抗性的抑制作用，但在体内攻毒试验中鸡只经肌肉注射HO2菌株后，对照组与试验组鸡只死亡率没有差别，发病情况基本一致，血样中细菌活菌数相近。表明Iss融合蛋白免疫14日龄雏鸡未表现免疫保护作用。Lynne A M等[15]采用GST-Iss融合蛋白免疫14日龄雏鸡，2周后用O1、O2、O78血清型大肠埃希菌菌株攻毒，结果仅O78型菌株攻毒组出现死亡，其中未免疫组死亡3只、免疫组死亡1只(每组12只)；其他组鸡只均无死亡。他们认为无死亡的鸡只中，免疫组的病变程度比未免疫组的轻，因此认为Iss蛋白具有免疫保护作用及做亚单位疫苗的潜力。本研究中，菌株HO2(血清型O2)免疫组和未免疫组均死亡1只鸡；CVCC1553菌株(血清型O78)攻毒组均未出现死亡，并且免疫组与未免疫组鸡只的病变程度无明显差异。这可能与菌株差异有关；但主要因素应是大肠埃希菌的毒力是受多毒力因子控制的，单一毒力因子制备的亚单位疫苗的免疫效果和保护潜力存疑。与血清抗性有关的基因较多，如iss、traT、K1荚膜、LPS合成基因、ompA等[13]。因此，选用遗传上较保守的基因(如iss基因)制备亚单位疫苗对大肠杆菌病进行预防虽然是较好的思路，有望克服现有疫苗不能进行有效交叉免疫保护的缺陷，但单一基因的亚单位疫苗对动物的保护作用是有限。这也解释了为什么有关亚单位疫苗的相关论文较多，但却几乎没有后续实际生产应用的报道[14]。探讨多基因联合的亚单位疫苗可能具有更好的实际意义。

[1] 樊 琛，刘桂芹，王亚君，等.Iss蛋白在鸡源大肠杆菌不同毒力菌株中的检测[J].畜牧与兽医,2010,42(2):71-73.

[2] 樊 琛,王亚君,李一经.iss基因与鸡大肠杆菌毒力相关性的分析[J].畜牧兽医学报,2005,36(1):58-61.

[3] Johnson T J,Giddings C W,Horne S M,et al.Location of in-creased serum survival gene and selected virulence traits on a conju-gative R plasmid in an avianEscherichiacoliisolate [J].Avian Dis,2002,46(2):342-352.

[4] Nolan L K,Giddings C W,Home S M,et al.Complement resistance,as determined by viable count abd cytan entic methods and its association with the presence of iss and the virulence of avianEscherichiacoli[J].Avian Dis,2002,46(2):386-392.

[5] 樊 琛,刘桂芹,王 宇,等.鸡源致病性大肠杆菌iss基因原核表达产物的免疫保护作用[J].畜牧与兽医,2010,42(11):84-86.

[6] Mohamed M A,Shehata M A,Rafeek E.Virulence genes content and antimicrobial resistance inEscherichiacolifrom broiler chickens[J].Vet Med Int,2014,195189.

[7] Mellata M,Dho-Moulin M,Dozois C M,et al.Role of virulence factors in resistance of avian pathogenicEscherichiacolito serum and in pathogenicity[J].Infect Immun,2003,71(1):536-540.

[8] Salehi T Z,Derakhshandeh A,Tadjbakhsh H,et al.Comparison and phylogenetic analysis of the ISS gene in two predominant avian pathogenicE.coliserogroups isolated from avian colibacillosis in Iran[J].Res Vet Sci,2013,94(1):5-8.

[9] Skyberg J A,Johnson T J,Nolan L K.Mutational and transcriptional analyses of an avian pathogenicEscherichiacoliColV plasmid[J].BMC Microbiol,2008,8(1):24.

[10] Oh J Y,Kang M S,Yoon H,et al.The embryo lethality ofEscherichiacoliisolates and its relationship to the presence of virulence-associated genes[J].Poult Sci,2012,91(2):370-375.

[11] Radwan I A,Salam H S H,Abd-Alwanis S A A,et al.Frequency of some virulence associated genes among multidrug-resistantEscherichiacoliisolated from septicemic broiler chicken[J].Int J Adv Res,2014,2(12):867-874.

[12] Salari S,Salehi T Z,Fasaei B N,et al.Construction of an iss deleted mutant strain from a native avian pathogenicEscherichiacoliO78:K80 andinvitroserum resistance evaluation of mutant[J].IJVR,2014,8:1-8.

[13] Li G,Tivendale K A,Liu P,et al.Transcriptome analysis of avian pathogenicEscherichiacoliO1 in chicken serum reveals adaptive responses to systemic infection[J].Infect Immun,2011,79(5):1951-1960.

[14] Ghunaim H,Abu-Madi M A,Kariyawasam S.Advances in vaccination against avian pathogenicEscherichiacolirespiratory disease:Potentials and limitations[J].Vet Microbiol,2014,172:13-22.

[15] Lynne A M,Kariyawasam S,Wannemuehler Y,et al.Recombinant Iss as a potential vaccine for avian colibacillosis[J].Avian Dis,2012,56:192-199.

[16] Lynne A M,Foley S L,Nolan L K.Immune response to recombinantEscherichiacoliIss protein in poultry[J].Avian Dis,2006,50:273-276.

[17] 李贵萧，朱宗涛，康燕青，等.鸡大肠杆菌的血清抗性与致病性检验[J]．江苏农业科学，2015，43(11):301-303．