FGF4在牛早期胚胎发育过程中的表达

刘瑞琪，王玮玮，屈鹏祥，马晓楠，王勇胜，卿素珠

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

成纤维生长因子(fibroblast growth factor，FGF)家族，又称为肝素亲和生长因子(heparin binding growth factor,HBGF)，是一类能促进成纤维细胞生长的多肽类活性物质，约有23种，大多数与肝素结合发挥作用[1]。 FGF对于细胞生长、分化是重要的调控因子；可维持早期胚胎发育和器官形成的祖细胞，并且调节它们的生长、分化,构成特定的组织；高度限制在特殊细胞亚型的特殊发育阶段；可促进细胞有丝分裂、趋化与血管生成、促进中胚层和神经外胚层细胞的存活与生长等[2]。

成纤维生长因子4是属于FGF4亚型因子，它可分泌带有切割的N-端信号肽的蛋白，通过旁分泌分泌到细胞外，结合和激活FGF受体(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)引起生物反应。研究表明，FGF4在小鼠早期胚胎发育过程中发挥重要作用。早在1994年，Rappolee等研究发现FGF4 mRNA是母源型转录因子[3]。近年的研究表明，在小鼠早期胚胎发育过程中，FGF4特异性的分布于内细胞团中，调控内细胞团分化为外胚层和原始内胚层，决定外胚层和原始内胚层的分布比例[4]，并且调控着外胚层和胚外外胚层交流的诱导信号[5]。随着研究的进一步深入，发现FGF4突变的小鼠胚胎在植入前死亡，可能是因为FGF4的异常表达干扰了早期胚胎发育过程中内细胞团的生长[6]。此外，有研究表明,敲除FGF4基因的小鼠也将导致胚胎植入后流产[7]，分析认为FGF4的异常表达影响了小鼠胎盘的发育及功能[8]。以上研究结果表明，FGF4是小鼠早期胚胎发育过程中一个重要因子，异常表达会影响早期胚胎的发育。目前，有关FGF4在牛早期胚胎发育过程中的分布及功能意义尚未见报道，本研究通过实时荧光定量PCR和免疫荧光染色技术，对FGF4在牛早期胚胎发育各个阶段的表达和定位规律进行研究，为探讨其在牛早期胚胎发育过程中可能的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 试验所用牛卵巢，采自西安市某屠宰场；冷冻精子，购自上海光明荷斯坦牧业有限公司。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒Cells-to-signal Kit，Invitrogen公司产品；反转录试剂盒cDNA synthesis kit，TaKaRa公司产品；荧光定量试剂盒SYBR Premix ExTaq，Promega公司产品；兔源Anti-FGF4多克隆抗体(ab106355)，Abcam公司产品；Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG二抗、免疫染色固定液、封闭液一抗、二抗稀释液和DAPI等，碧云天公司产品。采卵液、卵母细胞成熟液、精子获能受精液、胚胎体外培养液，按照文献配制[9]。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞的收集 采集的牛卵巢存放于含有100 mg/L链霉素、20 U/L青霉素的37℃生理盐水的恒温瓶中，4 h～6 h内送回实验室。生理盐水洗涤3次后，去除卵巢表面的附属组织，用12号针头注射器采用抽吸法抽吸卵巢表面的卵泡，将抽吸出的卵泡液置于直径60 mm平皿中，体视显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)，在采卵液中洗涤3次，选取卵丘细胞包裹较好且胞质均匀的COCs放入卵母细胞成熟液中培养，培养条件为38.5℃、体积分数为5%的CO2。

1.2.2 体外受精胚胎的收集 COCs在培养22 h～24 h后，利用移液枪吹吸数次，使颗粒细胞呈松散状，挑选带有第一极体的成熟卵母细胞在精子获能受精液中洗涤3次，收取10个MⅡ期(Metaphase Ⅱ)卵母细胞备用，然后将剩余卵母细胞放至精子获能受精液的微滴中(用矿物油覆盖)进行后续试验。提前将6 mL的精子获能受精液置于15 mL的离心管中，倾斜放置于38.5℃、体积分数为5%的CO2培养箱平衡8 h以上。将冷冻精子在38℃水浴中解冻，用玻璃吸管将其缓缓注入平衡好的精子获能受精液的离心管底部，之后45°倾斜离心管，于38.5℃、体积分数为5%的CO2培养箱静置45 min，使得精子能够自由上浮，吸取上清液部分，置于新的15 mL离心管中1 000 r/min离心10 min，弃上清，保留其底部200 μL的液体轻轻混匀，移入含有成熟卵母细胞的微滴中，在38.5℃、体积分数为5%的CO2条件下培养10 h～14 h。将受精的卵母细胞用10 g/L透明质酸酶完全清除颗粒细胞层后，移至胚胎体外培养液中洗涤3次，而后移到预先平衡4 h～6 h的胚胎体外培养液的微滴中，每个微滴放置约50个受精卵，在38.5℃、体积分数为5%的CO2中培养。在24、48、72、120、168 h分别收取2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚期的胚胎。

1.2.3 总RNA提取及cDNA合成 分别收取各时期的早期胚胎10个，按照RNA提取试剂盒Cells-to-signal Kit说明书提取胚胎总RNA，取不同时期胚胎的RNA 2 μg ，按照反转录试剂盒cDNA synthesis kit说明书反转录为cDNA，置-20℃保存。

1.2.4 实时荧光定量PCR 根据GenBank中公布的牛cDNA序列，利用Primer 5.0设计特异性引物(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以各时期的胚胎cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，反应体系：上、下游引物(0.2 mmol/L)各0.4μL，模板cDNA 2μL，SYBR○RPremix ExTaqTM Ⅱ 10μL，Passive ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL, ddH2O 6.8μL，总反应体系为20μL。每个样品重复3次，使用Step One real-time PCR system (Step One and Step One Plus;ABI)进行RT-PCR，反应程序：95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，通过2-△△Ct法计算FGF4的相对表达量。

表1 试验所用引物序列

1.2.5 免疫荧光染色 各时期胚胎经免疫染色固定液固定2 h，用PBS-PVA洗涤5 min×3。 3 mL/L Triton X-100室温透化30 min，PBS-PVA洗涤5 min×3。封闭液4℃过夜，PBS-PVA洗涤5 min×3。加入FGF4一抗(工作浓度1∶200)，4℃过夜孵育，PBS-PVA洗涤5 min×3。加入Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG二抗(工作浓度1∶1 000)，避光室温孵育2 h～4 h，PBS-PVA洗涤5 min×3，DAPI 染5 min，PBS-PVA洗5 min×3；抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并照相。

1.2.6 数据处理及分析 所有试验数据均重复3次，所得数据通过SPSS 19.0软件进行统计学分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 FGF4 mRNA在牛早期胚胎发育过程中的表达

不同时期牛早期胚胎中FGF4 mRNA的表达情况见图1。由图1可知，FGF4 mRNA在牛MⅡ期卵母细胞及早期胚胎的各阶段均有表达，相比于MⅡ期卵母细胞，FGF4 mRNA的表达量在2-细胞胚显著下降，随后持续增加，但在4-细胞胚时FGF4 mRNA的表达量仍低于MⅡ期卵母细胞，8-细胞胚时FGF4 mRNA的表达量已显著高于MⅡ期卵母细胞，至桑椹胚期FGF4 mRNA的表达量达到峰值，而后在囊胚期表达量显著下降、但仍高于8-细胞期及之前各时期胚胎中的表达量。

2.2 FGF4在牛早期胚胎中的分布规律

FGF4阳性反应呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光。不同阶段牛早期胚胎FGF4的分布情况见图2。由图2可知，FGF4蛋白在牛MⅡ期卵母细胞及各时期的早期胚胎中均有表达，但在不同时期胚胎的定位及反应强度有所不同。在MⅡ期卵母细胞、2-细胞胚及4-细胞胚，FGF4在卵母细胞及卵裂球的细胞质和细胞核中均有表达。而在8-细胞胚及桑椹胚，FGF4主要定位于卵裂球的胞质，而细胞核中未见阳性反应。至囊胚阶段，FGF4在内细胞团及滋养层细胞中均有表达，尤以内细胞团的反应更强，且主要定位于细胞质。

MⅡ.MⅡ卵母细胞；2-cell.2-细胞胚；4-cell.4-细胞胚；8-cell.8-细胞胚；M.桑椹胚；B.囊胚

MⅡ.MⅡoocytes,2-cell.2-cell stage；4-cell.4-cell stage；8-cell.8-cell stage；M.Morula；B.Blastocyst

图1 FGF4 mRNA在牛早期胚胎中的相对表达量

Fig.1 Relative expressional amount of FGF4 mRNA in bovine early stage embryos

3 讨论

Rappolee D A等[3]发现在小鼠胚胎中FGF4从MⅡ期卵母细胞至囊胚阶段均有表达，其在2-细胞期表达量有所下降，在囊胚期高度表达，认为FGF4是一种母源性转录因子。在哺乳动物中，精子染色质与卵母细胞染色质融合，形成合子基因组，合子型基因激活并转录，最终获得发育的全能性[10]。而在合子型基因激活前，细胞分裂受母源性转录因子调控，受精卵中储存着大量的母源mRNA、蛋白质、细胞器，这些物质合成更多的细胞因子，支持并指导早期胚胎的发育。在此过程中母源物质逐步消耗，直到合子型基因被激活，合子型基因的适时表达并完全取代母源基因，以实现胚胎发育由母源型调控向合子型调控的过渡。而缺少这一过程的动物胚胎无法进一步发育，胚胎发育受到阻滞,这表明母源型调控向合子型调控的转变对胚胎发育至关重要。值得注意的是，研究表明大部分母源因子，在合子型基因转录激活后仍表达，而且缺失这些母源因子对胚胎是致死性的[11]。然而，不同物种由母源性转录因子调控向合子型基因调控过渡的时期不同，小鼠的合子激活期为2-细胞胚胎晚期[12-13]，牛的合子激活期为4-细胞胚晚期或8-细胞时期[14]，这使得一些基因在小鼠和牛胚胎中的表达有所不同，并且同一个基因在合子激活前后表达亦有所不同。本研究通过qRT-PCR检测FGF4在牛早期胚胎中的表达规律，结果显示FGF4在牛的MⅡ期卵母细胞及各阶段的早期胚胎均有表达，与MⅡ期卵母细胞相比，2-细胞胚FGF4 mRNA表达量显著下降，随后持续增加，直至8-细胞期表达量显著高于MⅡ期卵母细胞，至桑椹胚阶段FGF4的表达量最高。这种表达规律可能是因为合子型基因激活前，母源因子FGF4维持了这段时期的细胞分裂，消耗其表达。但随着合子型基因的激活，FGF4的表达也得到了提高。

图2 FGF4在不同时期牛早期胚胎的分布

胚胎中细胞的分布决定细胞命运和极性[15]，母源因子在胚胎极性形成时发挥重要作用，8-细胞期获得极性是决定细胞命运的关键时期[16]。本研究结果表明FGF4在MⅡ期卵母细胞及8-细胞期前的各阶段早期胚胎的细胞质和细胞核中均有表达，而在8-细胞期及之后的桑椹胚和囊胚期FGF4只在细胞质中表达，这可能是因为FGF4在胚胎发育中与胚胎发育极性相关，然而FGF4在牛胚胎中迁移具体的机制仍需进一步研究。在小鼠囊胚中，FGF4特异性表达在内细胞团中，是形成功能性内细胞团所必须的[3,17]，通过影响种系特异性基因的分布，调控内细胞团分化原始内胚层的过程[18]。而本研究结果表明，牛囊胚中FGF4在内细胞团和滋养层中均有表达，并在内细胞团中表达水平较高，这与Takashi F及Manabu O的研究结果一致[19-20]。这可能是因为FGF4是一种分泌型蛋白，内细胞团能够分泌FGF4并通过旁分泌方式作用于滋养层细胞，其断裂的N端信号多肽通过结合并激活FGFRs作为细胞外蛋白介导生物反应，可与细胞溶质接头蛋白和RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ和STAT胞内信号旁路相互作用，从而进一步影响滋养层的增殖。另有研究表明，在胚胎附植后FGF4将调控功能性内细胞团的形成，并影响滋养层部分发育为胎盘组织的过程[7,21-22]。

本研究从mRNA和蛋白水平观察了FGF4在牛MⅡ卵母细胞及各阶段早期胚胎的表达模式，首次确定了FGF4在牛早期胚胎发育过程中的时空表达规律，为进一步研究FGF4基因在牛早期胚胎发育过程中的调控机制提供了依据。

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