禽呼肠病毒在鸡胚成纤维细胞系中的增殖规律

沈文康，谢芝勋，王 盛，黄 莉，谢丽基，黄娇玲，曾婷婷，张艳芳，张民秀，罗思思，范 晴，谢志勤，邓显文

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001)

禽呼肠病毒(Avian reovirus，ARV)是呼肠病毒科、正呼肠病毒属的成员，为双链RNA病毒，无囊膜，含10个节段，双衣壳结构，可感染鸡、火鸡、鹅、鸭及一些鸟类[1]，临床主要症状包括病毒性关节炎、腱鞘炎、肠道病、矮小综合征、吸收不良综合征及免疫抑制等，是家禽养殖业中一类重要的传染病，严重危害着养殖业的健康发展[2]。

ARV于1954年由Fahey和Crawley从病鸡中分离得到[3]；Olson等于1957年报道鸡群中有滑膜炎并分离出病原，1972年被确定为禽呼肠病毒[4]。自20世纪80年代以来，我国各省份及地区陆续报道了ARV感染的疫情，对ARV的研究也日渐深入，Vanderheide等用ARV S1133株生产出了第一代的商品化活疫苗应用于生产[5]；2012年起，我国ARV感染疫情逐渐扩大，主要症状也呈现复杂化、多样化。目前，养殖场普遍存在ARV感染，给养禽业带来了不可估量的经济损失，严重阻碍养禽业的发展。研究表明，ARV的细胞亲嗜性较广，能在绿猴肾细胞(Vero)、犬肾细胞(MDCK)、鸡胚成纤维细胞(CEF)、乳地鼠细胞(BHK-21/13)等多种细胞系中增殖，且产生稳定典型细胞病变[6]。丁明洋等[7]用鸭呼肠病毒TH11感染BHK-21细胞后可有效增殖，出现了稳定病变；黄莉等[8]用ARV强、弱毒株分别接种Vero细胞，并分析了接毒后细胞蛋白表达的差异；余爱花等[9]研究了3株鸭源ARV对鸭胚成纤维细胞的致病性，分析了接毒后细胞TNF-α表达水平的差异性。

有关ARV的研究已经较为深入，但研究ARV在DF1细胞上的增殖特性还未见报道，本文就此展开研究。通过将ARV S1133毒株接种DF1细胞，研究其增殖特性，旨在为下一步ARV致病机理的研究和细胞灭活苗的研制奠定技术和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、2.5 g/L胰酶,Gibco公司产品；PBS，Solarbio公司产品；禽呼肠S1133标准强毒株，中国兽医药品监察所提供；DF1细胞，由广西兽医生物技术重点实验室保存提供。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 参考NCBI上的ARV S1133株S2基因的核苷酸序列(登录号：KF741763.1)，用Primer 5.0软件设计引物，并由华大基因公司合成，引物序列见表1。

1.2.2 ARV S1133接种DF1细胞 将ARV S1133接种至生长良好的DF1细胞上，37℃孵育2h，更换维持液(含20 mL/L FBS的DMEM培养基)，在体积分数为5%的CO2中37℃培养，观察CPE。培养3 d后收细胞培养物，置-80℃冻存备用。取上述病毒液再接种细胞，培养3 d后收获细胞培养物，重复接毒3次。置-80℃冻存备用，测定第3代细胞培养物中的病毒滴度。

表1 ARV S2基因的核苷酸序列

1.2.3 RT-PCR检测 收获接毒后培养48 h的第3代细胞培养物，提取病毒RNA，用ARV通用引物反转录得到cDNA，将其作为模板用表1中的特异性引物进行PCR扩增，预期扩增片段大小为1 248 bp。PCR程序为94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 70 s，循环数为35；72℃ 10 min。PCR产物用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 一步生长曲线的绘制 将上述收获的第3代病毒液接种DF1细胞，分别收取接毒后12、24、36、48、72、96、120 h的病毒液，置-80℃冻存备用。将DF1细胞接种在96孔细胞板上，在体积分数为5%的CO2中37℃过夜培养，观察CPE及记录CPE孔数(重复此过程3次)。按Reed-Meunch法计算7个时间段的半数组织感染量(TCID50)(取3次重复试验的平均值)，绘制ARV在DF1细胞上的一步生长曲线。

2 结果

2.1 细胞病变

接毒12 h后即可观察到CPE，在48 h时最明显，主要细胞病变为细胞萎缩、破碎，脱落，成团，边缘不清晰，个别胞体出现变大，死亡等特征，对照组细胞生长良好(图1)。

A.正常；B.接毒后24 h；C.接毒后48 h；D.接毒后72 h

A.Normal；B.Post-infection 24 h；C.Post-infection 48 h；D.Post-infection 72 h

图1 DF1细胞形态(400×)

Fig.1 Morpha of DF1 cells(400×)

2.2 RT-PCR检测结果

收取接种ARV S1133株的第3代DF1细胞培养物，用RT-PCR检测。结果扩增到一条1 248 bp大小片段(图2)。对片段序列与所选的参考株同源性在99.99%以上，说明ARV S1133毒株在DF1细胞上增殖。

2.3 ARV S1133毒株在DF1细胞系上的增殖规律

ARV S1133接种DF1细胞后，分别收取12、24、36、48、72、96、120 h的细胞培养物，测其TCID50， 每个时间点分别做3次重复试验，取平均值。7个时间点的TCID50平均值分别为10-2.49、10-3.5、10-6.84、10-8.9、10-7.86、10-5.38、10-3.64，绘制出生长曲线(图3)。该曲线显示，ARV接种DF1细胞后，0～12 h为静止期，12 h～48 h为快速增长期，在48 h达到最大的病毒效价，TCID50为10-8.9/0.1 mL。

M.DNA 标准DL 2 000;1.PCR扩增产物；2.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR Product；2.Negative control

图2 ARV RT-PCR检测结果

Fig.2 Detection results of ARV by RT-PCR

图3 ARV S1133在DF1细胞上的生长曲线

3 讨论

随着养禽业的快速发展，禽病发生日益增多。近年来，多省份陆续有ARV感染疫情的发生，报道指出ARV有更广的宿主范围，更强的致病性，流行的疫区也日渐扩大，是一种严重危害养禽业健康发展的重要传染病[10]。目前，分离ARV一般采用鸡胚接种，此法虽然单次获毒较多，但需要的时间长，且操作繁琐，在快速获取大量病毒方面不具有时效性，在一定程度上反而限制了ARV的分离[11]。DF1细胞系来源于ELL鸡胚胎，该细胞无禽白血病病毒、肉瘤病毒内源性基因，同时在形态上呈纤维状，是一种稳定的、无肿瘤基因、自发无限增殖的细胞系。目前被广泛用于动物病毒研究、疫苗研制、癌症研究等诸多领域，是生命科学领域重要的病毒转染、培养生物材料。ARV基因组为RNA，而DF1细胞可用于反转录病毒的复制，DF1细胞系有助于ARV对细胞杀伤力的研究。为此，采用了细胞增殖病毒的方法，研究了ARV S1133毒株在DF1细胞上的增殖特性 ，大大缩短了获取大量病毒的时间，大幅提高了获毒效率。

定量描述病毒生长规律的实验曲线称为一步生长曲线，根据病毒的生长特点可划分为静止期、快速增长期、稳定期3个时期[12]。通常用来研究病毒在细胞上的增殖规律的方法主要有测定病毒的TCID50和病毒蚀斑试验[13-14]。本研究直接采取了测定病毒TCID50的方法，并用PCR检测、测序确定细胞仅有ARV感染，无其他病原污染。试验结果显示，ARV接种DF1细胞后，前24 h为静止期，24 h后进入快速增长期，并在48 h达到最大的病毒效价，即TCID50为10-8.9/0.1 mL。这一增殖规律可能与细胞的自身免疫机制有关，至于真正的原因，还待进一步的研究。本研究结果表明，ARV可在DF1细胞上有效地增殖，并伴有典型病变，在接毒48 h后出现病毒效价峰值，TCID50为10-8.9/0.1 mL。ARV感染DF1细胞的最佳收毒时间为接毒后的48 h。本研究结果可为下一步用DF1细胞研制ARV灭活苗及致病机理研究奠定基础[15]。

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