缓释载药微球在慢性牙周炎中的应用研究进展

卢静一 杨军星 王 雷

慢性牙周炎是是以牙周结缔组织破坏和牙槽骨吸收为特点的一种慢性炎症性疾病，其发病率高达80%以上，是成人失牙的主要原因。虽然口腔卫生指导、龈上洁治术、龈下刮治术和根面平整（scaling and root planing，SRP）等是牙周病最基本而有效的治疗方法，但受到牙齿解剖条件如根分叉病变、牙周袋深度等影响[1，2]，单纯SRP常不能彻底消除菌斑微生物，故局部药物治疗成为慢性牙周炎重要的辅助治疗手段之一。为了使局部牙周袋内药物浓度始终稳定保持在有效浓度范围内，且维持更长的作用时间，控释给药的方式较为理想。微球制剂是目前常用的控释给药方法，用于包载小分子药物、多肽蛋白质等生物大分子药物以及疫苗等。药物微球化后，能对药物进行控释，提高药物的稳定性和利用率，降低副作用，且由医师给药，提高了患者依从性，减少给药次数。作为一种新型的药物载体，缓释载药微球具有极大的发展潜力，现就其在慢性牙周炎治疗的应用研究进展综述如下。

一、载药微球材料

根据载药微球材料的生物学性质可分为两类：非生物可降解的载体材料，如聚丙烯、乙基纤维素和聚苯乙烯等；生物可降解的载体材料，包括天然高分子材料如明胶、淀粉、白蛋类、壳聚糖、海藻酸钠和合成高分子材料如聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等。其中生物可降解的载体材料因其安全、无毒，在辅助治疗慢性牙周炎中受到研究者的广泛关注。

1.壳聚糖（chitosan）

壳聚糖是天然聚阳离子碱性多糖，是自然界广泛存在的甲壳素脱乙酰化的产物。无毒，具有良好的生物相容性、生物可降解性和黏膜黏性，并具有抗菌消炎、促进伤口愈合、抗酸、降血脂等多重作用，被广泛应用于药物控释系统、医用敷料[3]、血液抗凝剂、软骨和骨组织工程支架材料[4]等。壳聚糖不溶于水，但可溶于醋酸、酒石酸、柠檬酸的稀释酸溶液，其基团上的阳离子可与黏膜表面、牙菌斑生物膜表面的阴离子反应，因此在牙周袋酸性环境中对黏膜、牙菌斑生物膜表面具有选择依附性和电中和性[5]。另有学者体外研究发现5mg/ml壳聚糖抑制牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌的生长，50μg/ml壳聚糖通过影响C-Jun氨基末端激酶通路调节PE2水平，进而表现出其抗炎特性[6]。

2.海藻酸钠（alginate）

海藻酸钠是从海带或海藻中提取出的一种水溶性阴离子多聚糖，是由古洛糖醛酸（G段）与其立体异构体甘露糖醛酸（M段）2种结构单元以三种方式（MM段/GG段/MG段）通过α-（1，4）糖苷键链接而成的一种线性嵌段共聚物[7]。当海藻酸钠与水接触时，能够形成具有粘附性的溶液，由此可以用来制备微球[8]。由海藻酸钠形成的凝胶具有PH敏感性，在酸性环境中几乎不溶胀，而在弱碱环境下能够发生溶胀，并且溶胀到最大溶胀比后开始溶解，这更有利于封装在内部的药物释放出来。

3.聚乳酸（polylactic acid，PLA）

PLA由植物发酵产物乳酸在特定条件下缩水聚合而成，易溶于氯仿、丙酮、乙腈等有机溶剂，在水、乙醇、乙酸乙酯及烷类溶剂中不溶。无毒无刺激性，具有良好的生物相容性、生物可降解性，在生物体内经过水解或酯解，最终形成二氧化碳和水。随着科学不断发展，发现尽管PLA有许多优点，但降解速度慢，药物释放不易控制[9]，因此，研究其微球的制备方法以改善其性能也成为很热门的课题。

4.聚乳酸 -羟乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）

PLGA由乳酸和羟乙酸聚合而来，可以通过改变两单体的比例和聚合条件来调节聚合物在体内的降解速度，从而控制所载药物的释放速度。PLGA具有如下优良特性[10]：①生物相容性和生物可降解性；②易溶于三氯甲烷、二氯甲烷等有机溶剂，容易制备；③通过美国FDA检查认证，美国药典将其收录可以作药用辅料；④缓控释药物；⑤易于调节表面特性，从而更好地与药物结合；⑥有良好的热塑性；⑦能够靶向结合到特定的组织和细胞。采用PLGA作为骨架材料包载多肽、蛋白质药物制成药物缓释微球，成为制剂研究的热点。

5.明胶（gelatin）

明胶是半透明、易碎、并且无色无味胶原蛋白，通常从鱼、猪、牛的皮、骨骼或者结缔组织中提取出来，作为胶凝剂广泛应用于食品、医药以及化妆品制造等领域。明胶不溶于冷水．加冷水后缓慢地吸水、膨胀、发生软化，最多可吸收5倍甚至10倍重量的水；在热水中溶解，冷却后溶液即凝结成胶块。明胶不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，但溶于乙酸和甘油，具有凝胶性、持水性、成膜性等特点，并且价格便宜，载药量高，组织相容性良好，被广泛用于生物医学材料。

二、微球的制备

缓释载药微球的常用制备方法主要有四种：喷雾干燥法、乳化-溶剂挥发法、乳化交联法、相分离法。

1.喷雾干燥法

喷雾干燥法是将药物加入到载体材料中搅拌分散均匀，再通过雾化器将制成的分散液快速雾化并喷入干燥、高温的惰性气体中，有机溶剂在高温下迅速蒸发，被雾化器分散的液滴快速凝固收缩、完成、干燥。制取微球时需要控制好溶剂与溶质的比例、溶液粘度、喷雾和喷气的速率、温度等。

该方法具有操作简单、包封率高、制得微球粒径均匀、一步成球等特点，不需要使用大量有机试剂，受高聚物性质影响小，微球包封率较高，批间重现性好。但是制备过程中所需的温度较高（＞100℃），不适于多肽类等对温度敏感的药物[11]。

2.乳化交联法

乳化交联法是经典制备壳聚糖微球的方法。药物与高分子材料连续搅拌形成稳定的乳液后，加入交联剂制得微球，微球逐渐固化，经过过滤、洗涤和干燥等操作得到最终的载药微球。交联剂中的活性基团醛基可以和高分子材料的氨基或醇基发生缩合反应，常见的交联剂包括阴离子交联剂、甲醛、戊二醛等。根据乳化和交联方式不同可以将乳化交联法分为乳化离子交联法、乳化化学交联法和复相乳化法。

该制备方法简单，易于操作，缺点是药物释放率受交联度影响很大[12]，且微球在体内降解后释放的少量交联剂是否对人体有害仍受质疑。

3.乳化-溶剂挥发法

乳化-溶剂挥发法是应用最广泛的微球制备方法，是将互不相溶的两相通过搅拌或超声制备成乳剂，再通过不断搅拌使有机溶剂挥发，最终乳滴逐渐变硬制成微球的方法，此法是制备PLA、PLGA微球最常用的方法。其操作简单，所制微球成球率高、球形圆整、表面光滑。乳化法可简单分为单乳法（包括W/O乳化法、O/W乳化法）、复乳法（W/O/W乳化法）。

该法制备微球需要控制好以下几点：聚合物浓度、溶剂的性质、搅拌方式、搅拌速率、反应时间、内外分散相溶剂及体积比等。该方法可以避免过高温度和可能引起相分离的凝聚剂，得到的微球粒径可在纳米范围内。但是由于溶剂蒸发可能导致药物泄漏在外相中，所以会使包封率与实际包封率有较大误差。

4.相分离法

相分离法是利用聚合物的物理化学性质，在含有药物和聚合物的混合液中加入对聚合物是非溶媒的液体，使聚合物的溶解度降低，聚合物包裹着药物从混合液中凝聚出来，在混合液中产生一个新相（凝聚相）的过程。此法分为四类：单凝聚法、复凝聚法、溶剂-非溶剂法、温度改变法。

相分离的过程是十分复杂的，投料比、搅拌方式、搅拌速率、絮凝剂的加入时间、加入量等均对微球的载药量和形态产生影响，进而影响药物的释放特性[14]。该法操作简单，易于实现工业化生产，制得微球球形圆整，缺点是载药量低，微球较大，容易发生粘连。

三、缓释载药微球治疗慢性牙周炎

慢性牙周炎是发生在口腔中最常见的疾病之一，菌斑中的细菌及其代谢产物是牙周炎发病的始动因子，宿主对其释放的毒力因子产生的急性炎症反应直接导致牙龈组织和牙槽骨的破坏。考虑到牙周炎的病因和发病机制十分复杂，主要有三种不同的治疗方法。①清除菌斑：是牙周炎治疗的基础；②调节宿主免疫反应，其目的是抑制破坏性的炎症反应；③牙周组织再生治疗。药物治疗是牙周病辅助治疗的重要方面，可有效控制慢性牙周炎的进展，近年来国内外学者对载药微球制剂治疗慢性牙周炎进行了大量研究。

1.载四环素族药物微球

四环素族药物是抑制牙周致病菌最重要的药物之一。其在慢性牙周炎中的作用机制主要包括①抗菌作用；②抑制胶原酶及其他基质金属蛋白酶的活性，从而抑制牙周组织破坏；③促进牙周膜细胞再生，促进牙龈成纤维细胞和牙骨膜成纤维细胞中的蛋白、胶原合成。

Yao W[14]等采用复乳/溶剂挥发法制备载米诺环素的聚乙二醇-聚乳酸纳米球（NP-MIN），粒径大小98±12nm，载药率和包封率分别为9.3%±0.2%和46.5%±0.9%。具有显著的缓慢控释特性，与盐酸米诺环素软膏（别名：派力奥）相比有效药物浓度持续时间长达12天，显著缓解了牙周炎的症状。许多学者研究发现与单纯SRP相比，应用米诺环素微球作为辅助治疗时，牙周袋探诊深度（PPD）、探诊出血（BOP）、附着水平（CAL）明显改善，红色微生物复合体数量明显减少，效果优于前者[15～19]。然而Killeen AC[20]实验研究得出结论是米诺环素微球作为辅助治疗，上述参数明显改善，但与单纯SRP治疗相比无统计学差别，与Tabenski L[21]的研究结论相同。Oringer RJ[22]在研究米诺环素微球对骨吸收标记物的影响中指出，局部应用米诺环素微球一个月后龈沟液中IL-1水平明显下降，Killeen AC[20]亦得出此结论，但长期效果有待研究。

Moura LA[23]等通过复乳溶剂挥发法制备多西环素PLGA微球，获得微球载药量为16%，包封率达到80%，平均粒径小于1μm，多西环素从该微球中缓慢稳定释放时间长达15天。Rao SK[24]研究多西环素微球药效学实验中指出，PPD从治疗初期到6月减少大约2mm；CAL从治疗初期到6月改善0.9mm，与对照组（单纯SRP）相比临床参数明显改善，其差别具有统计学意义。除1到3月以外的其余时间段，牙龈卟啉单胞菌数目明显减少。

2.载硝基咪唑类药物微球

甲硝唑是一种高效廉价的、能杀灭专性厌氧菌的药物，可有效杀灭牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌、螺旋体及消化链球菌等，对由这些细菌引起的牙周炎具有良好的治疗效果。Pichayakorn W以壳聚糖为载体用乳化交联法制备甲硝唑微球，通过各种手段对不同制备条件下制得的微球包封率、粒径大小、表面形态等性质进行评价，得出最佳组合为：5%戊二醛，30min交联时间，投药比1：1。所制备的微球球形圆整，有良好的黏膜粘性，平均粒径大小为42.82μm，包封率为59.40%，具有明显的缓释作用，由该微球组成的凝胶其释药性能优于纤维[25]。

奥硝唑和培氟沙星分别对厌氧菌和兼性厌氧菌抑菌效果明显，两者联合使用可发挥高效抑菌效果。刘锐[26]采用复乳-溶剂挥发法制备复方奥硝唑/培氟沙星PLGA微球，制出微球的成球形良好，光滑均匀，粒径大小为21.60±6.41μm，奥硝唑和培氟沙星的包封率平均为68.15%±0.4%和64.07%±0.37%，载药量分别为6.18%±0.15%和3.95%±0.21%。24h后奥硝唑在体外释放率达25%左右，培氟沙星则达到35%左右，存在一定的“突释效应”。随时间推移，微球释放药物速率基本保持稳定，到20天药物基本释放完毕。有学者在PLGA材料外再包裹一层壳聚糖，在很大程度上抑制了“突释效应”，但这种符合载体材料不适合于注射剂型使用[27]。“突释效应”并不是没有任何利用价值，适当的突释会起到“首剂加倍”的作用，一定程度上对细菌的抑制效果产生了积极的促进作用[28]。

3.载他汀类药物微球

他汀类药物是一类降脂药物，具有抑制3-羟基-甲基戊二酰辅酶A还原酶的作用，主要应用于高胆固醇的治疗。此外还具有抗炎、抗氧化的特性，可通过增加骨细胞中BMp-2的表达刺激骨组织新生，故为牙周炎的治疗提供了一个新的方向[29]。

Ho MH[30]采用o/w乳化法制备载洛伐他汀的PLGA微球，药物/PLGA比为0.032时制备的微球3天后突释70%，7天后药物释放量为97%。体外细胞实验显示应用此微球，细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性显著增加，特别在第3、5、7、9天时。洛伐他汀＞4μg/ml时细胞ALP活性明显下降甚至低于原来水平，用PLGA包载洛伐他汀则不会表现出此细胞毒性。尽管促进骨再生的最适药物浓度不确定，但该微球在骨缺损治疗中有很大的发展潜力。

考虑到控制炎症和促进骨再生是治疗牙周病的重要途径，Lee BS[31]等人采用复乳法制备载洛伐他汀、四环素的PLGA-壳聚糖制成纳米粒，平均粒径为111.5nm，在投药比为0.1%、0.3%、0.5%的微球中洛伐他汀的包封率分别为69.1±4.0%、69.8±4.6%、70.3±4.3%，四环素的包封率分别为10.6±2.7%、22.4±3.1%、32.1±2.6%，微球经过起初的突释后缓慢释放药物时间长达14天，洛伐他汀的控释较四环素稍晚，可持续21天之久。利用微型CT对新生骨定量分析并测量其体积，结果表明该微球具有良好的骨再生潜能。

4.载多肽和蛋白质类药物微球

多肽和蛋白质类药物已逐渐成为一类十分重要的治疗用药，但是其存在不少缺陷：如生物半衰期短，易受到酶降解影响，难以通过生物屏障等。因此制备其缓控释制剂对改善生物大分子的临床应用具有显著优势。

（1）调节宿主免疫：研究表明 25（OH）D3可被不同的牙周细胞羟基化，通过与维生素D受体（VDR）结合行使生物功能。25（OH）D3可抑制炎症相关信号通路NF-kB、STAT3的表达，从而抑制过度炎症反应和牙周破坏。Li H等[32]采用乳化溶剂挥发法制备出载25（OH）D3的PLA微球，微球粒径为（42.3±5.8）μm，载药量和包封率分别为（15.8±0.5）%和（79.2±1.9）%，药物缓慢释放持续时间长达70天。经体外模拟糖尿病性牙周炎环境和小鼠模型研究，发现25（OH）D3-PLA微球能够抑制糖尿病型牙周炎的炎症反应，为其提供了有效的治疗手段。

Glowacki AJ[33]以 CCL22（趋化因子C-C-基元配体22）为药剂制备了PLGA微球，体内、体外研究表明该微球可有效促进调节性T细胞（Treg）聚集，Treg细胞能影响免疫环境，维持内环境平衡。微球缓慢释放CCL22，有效的减少了牙周组织中促炎性细胞因子的产生以及软硬组织的破坏。

（2）促进牙周组织再生：多种不同的生长因子可促进牙周组织再生，例如骨形态发生蛋白（BMPs）、转化生长因子、纤维母细胞生长因子等。Soran Z等[34]先用电子喷雾技术制备BMP-6的明胶微球，再通过冷冻干燥法在其外包裹一层壳聚糖支架，制得微球成球性良好，平均粒径为360μm，控释时间为6天。体外细胞培养结果表明由于BMPs的加入，骨髓源性大鼠间充质干细胞的成骨细胞分化功能明显提高。

Chen FM等[35]采用乳化-交联法制备载釉质基质蛋白-右旋糖酐PLGA微球（EMPs-dex-MPs），微球平均粒径为25μm，EMPs载药量为32.8±1.2%，包封率为78.9±1.0%，第20天释放总药量的80%。体外实验研究表明该微球明显提高人牙周膜细胞的分化和碱性磷酸酶活性，作用时间≥12日。

四、小结

近年来微球制剂已经成为药物研发机构和生产企业的热点剂型，其载药种类多样，载药方式各异，在牙周炎的抗炎治疗及牙周组织再生治疗中均能取得了一定的疗效，但大多为体外模拟实验研究。总的来说，作为口腔卫生指导、龈上洁治、龈下刮治和根面平整术的辅助治疗，局部应用缓释载药微球比单纯机械性菌斑控制效果更好。然而微球制备方法较复杂，其理化特性如成球性、包封率、载药量等易受影响，并引发突释效应，牙周炎的治疗效果易受影响。因此，今后还需逐步改良现有微球和研发新型微球，进一步干预临床试验研究缓释载药微球长期治疗效果，明确其在牙周炎治疗中的应用价值。

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