结直肠癌患者K-ras基因的突变分析

李 勇，汪志伟，郭 芳

1武汉亚洲心脏病医院，湖北 武汉 430022；2湖北省肿瘤医院，湖北 武汉 430079

结直肠癌（CRC）是一种常见的恶性肿瘤，分子靶向药物的出现，使得CRC的治疗获得了较大进展，K-ras基因的突变状态是决定CRC靶向治疗是否有效的关键性指标[1]。有大样本研究报道我国CRC的K-ras基因突变率为43.8%[2]，K-ras基因在CRC发生、发展过程中起重要作用，但大多数研究报道对K-ras基因突变与患者临床特征间的相关性研究所得结论各有差异[3-6]，尚未有定论。本研究主要检测CRC患者K-ras基因的突变情况，以探讨K-ras基因突变的特点及其与临床相关病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2016年1～6月我院收治的148例经手术治疗且术后病理确诊的CRC患者，男性91例，女性57例；年龄23～81岁；结肠癌66例，直肠癌82例；腺癌137例，肝转移15例，淋巴结转移55例，脉管内癌栓44例，神经侵犯35例。纳入标准：（1）结直肠癌行手术治疗患者；（2）手术后切除活检并行病理检查，病理标本行基因检测；（3）患者术前未接受放、化疗。排除标准：（1）术前接受放化疗；（2）术后未行病理检查患者，标本未行基因检测。

1.2 检测方法

（1） 标本采集：CRC的原发病灶、转移的淋巴结、远处转移病灶等标本，放入福尔马林中固定保存；（2）DNA提取：运用DNA试剂盒对上述组织进行DNA提取；（3）K-ras基因检测：采用荧光定量PCR方法检测K-ras基因的突变类型及位置。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行卡方检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 K-ras基因突变与CRC患者临床病理特征的关系

148例CRC患者中突变76例，突变率为51.3%，K-ras基因突变在患者年龄、性别、肿瘤部位、肝转移、淋巴结转移、脉管内癌栓、神经侵犯、病理分型的差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 K-ras基因突变与CRC患者的临床特征的关系

2.2 K-ras基因第12、13位密码子突变与CRC患者临床病理特征的关系

148 例CRC患者中46例第12位密码子突变，突变率31.0%；第13位密码子突变16例，突变率10.8%。第12位与第13 位密码子突变在性别及肿瘤并发脉管内癌栓时，差异有统计学意义（P＜0.05），而在年龄、肿瘤部位、肝转移、淋巴结转移、神经侵犯、病理分型等因素上，差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

2.3 K-ras基因的突变位点

148例患者中突变76例，其中2号外显子12位及13位密码子突变62例（81.5%），3号及4号外显子突变14例（18.4%）。

3 讨论

CRC是全球最常见的消化道肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势[7]。其发生和发展是一个多基因、多阶段协同发展的过程。K-ras基因的突变在其中发挥着重要的作用。K-ras属于ras基因家族，以点突变为主，常见于12、13位密码子[8]。ras蛋白为膜结合型的GTP/GDP结合蛋白，通过GTP/GDP之间的转换来实现k-ras基因对信号系统的开启与关闭，传递细胞生长分化信号。正常细胞中，ras蛋白与GDP结合，处于非活性状态；当K-ras基因突变时，阻断了ras蛋白的GTP酶活性，使结合于ras的GTP不被水解，从而使K-ras基因处于持续激活状态，刺激细胞不断生长分化，最终导致细胞的恶性转化[9-11]。

表2 第12、13位密码子突变与CRC患者临床特征的关系

对于早期的CRC可行根治性切除术，晚期的患者行术前放、化疗再行手术，无法手术的患者以5-Fu为核心的全身化疗方案。近年来在CRC的治疗中，直接作用于表皮生长因子受体的分子靶向药物西妥昔单抗的出现，使其成为CRC的一线治疗药物。表皮生长因子受体在CRC中的表达率为60%～80%[12]，是一种受体酪氨酸激酶与配体结合后，经过转导将信号传递到细胞核内，可促进细胞增殖、血管生成，最终导致肿瘤生长、侵袭及转移。阻断表皮生长因子受体的信号转导，可抑制肿瘤细胞生长、肿瘤新生血管形成、肿瘤的侵袭和转移。西妥昔单抗能与表皮生长因子受体特异性结合，竞争性阻断表皮生长因子受体与配体结合，从而阻断受体的信号转导，还可以靶向诱导细胞毒免疫效应细胞作用于表达表皮生长因子受体的肿瘤细胞，从而发挥抗肿瘤活性[13]。野生型K-ras基因受上游的表皮生长因子受体信号调控，但K-ras基因突变时其处于持续活化状态，即使应用西妥昔单抗阻断表皮生长因子受体的信号转导，突变的K-ras基因可不受影响，仍能使表皮生长因子受体下游的信号通路继续传递导致肿瘤细胞的继续增殖。多项研究结果也表明K-ras基因野生型可从西妥昔单抗治疗中获益，而突变型不能，反而会增加不良反应的风险[14-16]。靶向治疗也可联合化疗药物能降低疾病进展的风险。

本研究共收集148例患者，突变76例，结果表明k-ras基因突变与患者年龄、性别、肿瘤、肝转移、淋巴结转移、脉管内癌栓、神经侵犯、病理分型等均无关（P＞0.05）。第12位与第13 位密码子突变在性别及肿瘤并发脉管内癌栓时，差异有统计学意义（P＜0.05），提示12位密码子突变多见于男性，13位密码子突变可能多见于女性；有脉管内癌栓者多发生13位密码子突变。本研究中CRC最常见的突变位点是2号外显子的12位及13位密码子与Xiao等[8]研究结果相一致。对于肿瘤的分化程度本研究未进行分析，有研究表明K-ras基因突变与分化程度相关[4]。对于TNM分期与K-ras的突变关系各种研究报告的结果各不相同[17]，本文也未做研究，但本研究所选取的病例未进行系统的术后随访，故对患者的预后情况未做详细阐述，有研究表明K-ras基因的第12、13 位密码子突变提示预后不良，而第13位突变的患者更易复发[18-20]。所以检测基因的突变位点对于患者的预后有一定的临床价值。

K-ras基因在CRC的发生、发展及转移等各个阶段起重要作用。深入研究K-ras基因的结构、功能及突变规律对CRC的防治具有重要意义。本研究样本量较小及分析方法不同，K-ras基因突变与患者的临床病理关系及常见的突变位点仍需大样本、多中心的临床研究加以验证。

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