高效液相色谱法测定黄七胶囊中人参皂苷Rg1、 Rb1及三七皂苷R1的含量

彭修娟 杜志德 顿宝生 杨新杰

(1 陕西国际商贸学院，咸阳，712046； 2 陕西中医学院，咸阳，712046)

中风又名卒中,其基本病机为阴阳失调、气血逆乱、上犯于脑,导致脑脉痹阻或血溢脑脉之外,临床以卒然昏仆、不省人事、半身不遂、口舌歪斜、语言不利、偏身麻木为主症的一种疾病[1]。因本病起病急剧,变化迅速,与自然界善行而数变之风邪特性相似,故古人以此类比,名为中风[2]。中风是中医学中的4大顽疾之一,具有发病率高、复发率高、致残率高、病死率高的特点,严重危害人民健康的疾病[3]。中风初发时以风证为主；发病1～2周时,以痰湿证、血瘀证为多；恢复期以血瘀证、气虚证为多[4]。现代血液流变学研究表明,中风患者血液存在着“浓”(红细胞比容增高)、“黏”(全血黏度比、血浆黏度比和纤维蛋白原增高)、“聚”(红细胞时间性泳时间长)的情况[5]。故益气活血法为中风、特别是中风恢复期的重要治疗法则。

黄七胶囊是在黄七汤的基础上研制而成，由黄芪、土鳖虫、三七、葛根四味药材组成，具有益气活血，化瘀通络之功效。用于气虚血瘀，脉络瘀阻所致的中风恢复期，对半身不遂，肢体麻木，口眼歪斜，言语不清或不语，感觉减退或消失治疗效果良好[6]。方中佐药三七具有散瘀止血、消肿止痛之功效，《医学衷中参西录》谓之：“化瘀血而不伤新血，允为理血妙品”[7]。现代研究证明，三七具有明显的脑组织保护作用且能改善脑部血液循环[8-9]；三七所含的人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1等有效成分能明显扩张脑血管、降低脑血管阻力、增加脑血管血流量，对颈部动脉亦有扩张作用，对颅脑损伤有保护作用[10-11]；可改善脑缺血再灌注损伤后脑组织能量代谢,促进缺血脑组织对能量物质的利用[12]；能减轻缺血脑组织的炎性反应，保护缺血脑组织[13]；能保护神经元，降低脑缺血后梗死体积及水肿体积[14]；能改善血管内皮功能，降低血液黏度，抑制血小板活化和聚集从而具有抗血栓形成的作用[15]。在新药研制过程中，对黄七胶囊中三七的3种功效成分—人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1进行方法学研究，建立科学合理、专属性强的高效液相含量测定方法。所建方法专属性强、重现性好、样品检测结果稳定，可用于本制剂的质量控制。此外，按不同的比例的乙腈-水进行梯度洗脱，以峰面积为筛选指标，优选出3种成分的最佳流动相比例完全相同，即：0～30 min，乙腈19→40，水81→60。该流动相梯度洗脱比例同《中华人民共和国药典》2010年版一部[16]比较，提高了峰面积和理论塔板数，并节省了时间。

1 仪器与试药

1.1 仪器 P3000型高效液相色谱仪，P3000型紫外检测器；CXTH-3000色谱工作站，7725i进样器；UV-755B紫外可见分光光度计。

1.2 试药 10批样品由杨凌无为制药集团有限公司自制；人参皂苷Rg1对照品(批号：110703-200726)、人参皂苷Rb1对照品(批号：110704-200420)、三七皂苷R1对照品(批号：110745-200617)，皆为供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供。3批研究用中试样品由该公司胶囊剂车间生产；乙腈和甲醇皆为色谱纯，水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

2.1.1 色谱条件 以十八烷基硅烷合硅胶为填充剂，柱压：11.0 MPa，流速：1.0 mL/min；柱温：45 ℃。理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4 000。拖尾因子为1.03。

2.1.2 流动相的选择比例 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱，按正文方法用对照品溶液作图，以峰面积为筛选指标，找出最佳流动相比例。三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品流动相结果见表2～4。

表1 流动相梯度设置

表2 三七皂苷R1对照品流动相选择结果

注：—为无数据

表3 人参皂苷Rg1对照品流动相选择结果

注：—为无数据

表4 人参皂苷Rb1对照品流动相选择结果

注：—为无数据

从表1可以看出，比例5为最佳流动相洗脱比例，即：时间0～30 min，流动相A19%→40%，流动相B81%→60%。

该洗脱比例同《中华人民共和国药典》2010年版一部三七含量测定项下的流动相梯度洗脱比例相比较，提高了峰面积和理论板数，并节省了检验时间。在此条件下，三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1的保留时间分别为：12.865 min、14.647 min、26.714 min。对照品、中试样品、三七的阴性对照色谱图分别见图1～3。

图1 三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1色谱图

2.2 提取方法

2.2.1 提取溶剂的选择 人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1在甲醇、乙醇和水中均有较好的溶解度，用水、50%甲醇、100%甲醇、50%乙醇和100%乙醇提取并进行比较，选择出最佳的提取溶剂。取样品(批号：20140406)5份(约1.0 g)精密称定，分别精密加入上述5种溶剂50 mL，称定质量，放置过夜，置80 ℃水浴上保持微沸2 h、放冷，再称定质量，分别用5种溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，结果表明，用甲醇作为提取溶剂3种皂苷提取率最高，杂质干扰最少，故选择甲醇作为提取溶剂。

图2 中试样品色谱图

图3 三七的阴性对照色谱图

2.2.2 提取时间的确定 分别称取样品约1.0 g(批号20140406)5份，精密称定，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，放置过夜，置80 ℃水浴上保持微沸0.5、1、2、3、4 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液。分别精密吸取对照品与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，结果表明，保持微沸3 h，即可使样品中3种皂苷提取率最高，故保持微沸时间确定为3 h。

2.3 测定方法的选择

2.3.1 最大吸收波长的选择 分别吸取人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1对照品溶液(浓度分别为：0.424 8 mg/mL、0.426 9 mg/mL、0.101 0 mg/mL)在200～250 nm范围内进行光谱扫描，结果表明，3种皂苷在203 nm处皆有最大吸收。

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1对照品溶液(浓度分别为：0.424 8 mg/mL、0.426 9 mg/mL、0.101 0 mg/mL)2、4、8、12、18 μL，HPLC测定峰面积，三者的回归方程分别为Y=377341X+31058.2(r=0.999 9，n=6)、Y=285 201X+461 3.9(r=0.999 9，n=6)、Y=398 066X-159 9.4(r=0.999 9，n=6)。

研究结果表明，人参皂苷Rg1进样量在0.849 6～7.646 4 μg，Rb1在0.853 8～8.853 8 μg，三七皂苷R1在0.202 0～2.020 0 μg范围内皆与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3 稳定性试验 取本品(批号20140406)精密称定，按优选的提取方法制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h进行测定，即得。结果上述3种皂苷的RSD分别为1.51%、1.21%、1.30%，表明本品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 精密度试验 取人参皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1对照品溶液，重复测定5次，记录峰面积，结果上述3种皂苷的RSD分别为0.93%、0.69%、0.42%，结果表明本方法精密度较好。

2.3.5 重复性试验 取批号为20140406的样品6份，按优选的提取方法制备供试品溶液，测定含量，结果上述3种皂苷的RSD分别为1.89%、1.59%、1.37%，表明本方法重复性良好。

2.3.6 回收率试验 取已知含量的样品(批号20140406，人参皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1的含量分别为5.490 7 mg/粒、4.342 8 mg/粒、1.057 7 mg/粒)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入人参皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1对照品溶液(浓度分别为0.335 8 mg/mL、Rb10.329 3 mg/mL、0.168 1 mg/mL)25 mL，再精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，放置过夜，置80 ℃水浴上保持微沸3 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，依法测定，结果三者的平均回收率分别为99.60%(RSD=1.53%)、100.10%(RSD=1.68%)、99.04%(RSD=1.40%)。结果表明，三者的回收率均良好。

2.4 样品测定 按处方量的1/10，分别制备7批样品，连同成型工艺研究试验的3批样品，依据正文中含量测定方法，进行含量测定。见表5。经对10批样品中人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的总量的测定，平均值为11.04 mg/粒，考虑到药材来源及大工业生产等因素，暂定每粒含三七以人参皂苷Rg1(C42H72O14)、人参皂苷Rb1(C54H92O23)和三七皂苷R1(C47H80O18)三者的总量计，不得少于8.8 mg。

表5 样品中人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷 R1总量测定结果

2.5 验证实验 采用云南文山产的三七投料，制得的3批中试样品，批号：20140602、20140605、20140608，对三七所含人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的总量进行了测定。另外在该处方中取掉三七，按正文生产工艺投料制作，制成阴性对照品，分别进行含量测定。见表6。

表6 中试样品含量测定结果

以上3批中试样品含量均符合规定，平均测得值为11.0 mg/粒，含量测定成分的转移率为80.0%，证明该标准所制定的三七含量限度可行，阴性对照品在相应部位未出峰，证明处方中其他药材对本含量测定无干扰。

3 讨论

在流动相选择比例试验中，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，这和中华人民共和国药典2010年版一部三七含量测定项下一致[5]。按不同的A与B的比例进行梯度洗脱，以峰面积为筛选指标，优选出的流动相梯度洗脱比例同中华人民共和国药典比较，提高了峰面积和理论塔板数，并节省了时间。经分别筛选，3种成分的最佳流动相比例完全相同。

虽然提取溶剂与中华人民共和国药典相同皆用甲醇，但提取时间由中华人民共和国药典的2 h优选成了3 h，在这样的时间条件下，3种皂苷的提取率皆最高。

在本实验条件下，稳定性、精密度、重复性、线性关系良好。3种功效成分的回收率皆在99%以上，经10批样品及3批中试样品的验证实验，证明该标准所制定的三七含量限度可行，阴性对照品在相应部位未出峰，证明处方中其他药材对本含量测定无干扰。

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