蒙药熊胆治疗应激性胃溃疡出血模型大鼠的主要成分及机制研究

萨茹拉 吴玉小 吴伟红 白 珍 白长喜

(1 天津中医药大学，天津，300193； 2 内蒙古自治区国际蒙医医院，呼和浩特，010065； 3 内蒙古医科大学蒙医药研究所，呼和浩特，010020)

胃溃疡出血属于上消化道出血，胃损伤、溃疡是导致胃出血的常见原因[1]。胃溃疡及消化性溃疡是一种常见的消化道疾病。主要的病因由幽门螺旋杆菌感染和药物及饮食因素导致。如长期服用阿司匹林、皮质类固醇等药物及长期吸烟、饮酒、喝浓茶、咖啡等易致此病发生。出血是胃溃疡最常见的并发症，是溃疡基底血管被侵蚀破裂所致，因此止血与促进溃疡修复、愈合是胃溃疡合并出血治疗的关键手段[2]。

蒙医学认为胃溃疡出血属“血病”的一种，蒙医药治疗“三根”失调导致的胃溃荡出血有着丰富的经验和独到的特色，在蒙医学理论体系中，胃溃疡出血的病因为饮食不节，邪热伤肝，水谷精不能化，恶血激增溢于胃，血不循径，三根失调导致[3]。本实验为了探讨蒙药熊胆及主要有效成分治疗胃溃疡出血性模型大鼠对溃疡基底血管被侵蚀破裂出血后止血与促进溃疡修复、愈合等作用进行初步观察。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠130只，雌雄各半，6～8周龄，体质量(200±20)g，由北京维通利华实验技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2012-0004。

1.1.2 药物 熊胆粉(0.25 g/瓶×4瓶)(福建归真堂药业股份有限公司生产，国药准字Z10980024)；熊去氧胆酸(上海生工生物工程股份有限公司生产，批号：BB07BA0324)；牛磺熊去氧胆酸(上海化成工业发展有限公司生产，批号：3MQWC-BP)；胆酸(美国Sigma公司生产，批号：SLBH1420V)止血红花-8味散(内蒙古国际蒙医医院国家蒙药制剂中心生产，呼卫制注字(97)001-133号)；吲哚美辛胶囊(消炎痛，湖北东信药业有限公司生产，国药准字H42021462)；奥美拉唑肠溶胶囊20 mg(石药集团欧意药业有限公司生产，国药准字H20046430)。

1.1.3 试剂与仪器 5-HT ELISA KIT，规格：96T，产品编号：E02H0106；AngⅡ ELISA KIT，规格：96T，产品编号：E02A0204；VEGF ELISA KIT，规格：96T，产品编号：E02V0010；均由美国R&D公司生产。无水乙醇500 mL(天津市赢达稀贵化学试剂厂)；甲醛溶液500 mL(天津虔诚伟业科技发展有限公司)；超净工作台；电子天平；全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)；水平离心机；MK3型酶标仪；电热恒温培养箱(DH4000A，天津泰斯特)；MINI shaker(MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER)；移液器；EP(0.1 mL，0.2 mL，1 mL)等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 模型釆用吲哚美辛加无水乙醇法建立实验性大鼠应激性胃溃疡出血模型，将130只SD大鼠随机分为空白组、模型组、奥美拉唑组、止血红花-8味散低和高剂量组、熊胆粉低和高剂量组、熊去氧胆酸(UDCA)低和高剂量组、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)低和高剂量组、胆酸(CA)低和高剂量组，10只/组。

1.2.2 给药方法 空白组和模型组灌胃等容积的0.9%氯化钠注射液，止血红花-8味散低剂量组270.1 mg/kg、止血红花-8味散高剂量组539.9 mg/kg、熊胆粉及其主要成分低和高剂量组分别以45.7 mg/kg、91.5 mg/kg浓度的量每100 g大鼠1 mL的灌胃量灌胃(止血红花-8味散由熊胆50 g、藏红花50 g、菀豆花40 g、红檀35 g、地锦草35 g、石斛35 g、制木鳖子25 g、朱砂25 g等8味药组成。由止血，清热，凉血功能。主治“宝日”病，胃肠出血，外伤流血，流鼻血，吐血，月经过多等多种出血症。1～3次/d，1.5～3 g/次，温开水送服。大鼠灌胃剂量为临床给药剂量按人的平均体质量70 kg计算，根据人和大鼠给药剂量系数换算得出)；连续给药7 d后，禁食24 h，胃出血造模用吲哚美辛(消炎痛)加乙醇法，ip消炎痛7.5 mg/mL，1 mL/100 g体质量，0.5 h后，观察组分别灌胃相应药物，1 mL/100 g体质量，空白组灌胃等容积的0.9%氯化钠注射液，3 h后重复灌胃1次，第2次灌胃2.5 h后，模型组和观察组再灌胃50%乙醇，1 mL/100 g体质量灌胃。

1.2.3 检测指标与方法 末次给药后1 h，用乙醚将大鼠致昏迷，背位固定，心脏穿刺取血5 mL，在室温放置2 h后3 000 r/min离心10 min，取上清液得到待测血清。严格按照各个试剂盒说明书步骤操作，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法，测定血清5-HT、AngⅡ和VEGF的水平。

2 结果

2.1 蒙药熊胆及主要成分对血小板计数的影响 空白组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组与空白组、奥美拉唑组、蒙药熊胆及主要成分观察组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。熊胆粉低和高剂量组、UDCA高剂量组、TUDCA低和高剂量组与奥美拉唑组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 蒙药熊胆及主要成分对血小板计数的影响

注：与空白组比较*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与奥美拉唑组比较，▲P>0.05

2.2 蒙药熊胆及主要成分对大鼠血清的影响 与空白组比较，5-HT其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)，AngⅡ除奥美拉唑组和UDCA高剂量组外，其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)，VEGF除奥美拉唑组和TUDCA高剂量组外，其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，5-HT其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)，AngⅡ除CA低剂量组外，其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)，VEGF除止血-8低剂量组、熊胆粉低剂量组、CA低剂量组和CA高剂量组外，其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图1 空白组SD大鼠胃组织形态(HE，×20)图2 模型组SD大鼠胃组织形态(HE，×20)

图3 奥美拉唑组SD大鼠胃组织形态(HE，×20)图4 止血⁃8低组SD大鼠胃组织形态(HE，×20)

图7 熊胆粉高组SD大鼠胃组织形态(HE，×20)图8 UDCA低组SD大鼠胃组织形态(HE，×20)

图9 UDCA高组SD大鼠胃组织形态(HE，×20)图10 TUDCA低组SD大鼠胃组织形态(HE，×20)

图13 CA高组SD大鼠胃组织形态(HE，×20)

2.3 蒙药熊胆及主要成分对胃组织病理学观察 HE染色显示，空白组大鼠胃壁组织在光镜下可见黏膜层、黏膜下层、肌层及外模层结构连续、完整；黏膜层腺体排列紧密、整齐；上皮细胞形态正常、无炎性细胞浸润、上皮脱落等表现。模型组大鼠黏膜层结构紊乱、胃腺体排列疏松、腺上皮细胞水肿，黏膜上皮缺失、片状脱落、局部可见炎性细胞；固有层微血管充血、炎性细胞浸润明显；黏膜下层疏松水肿、可见炎性细胞渗出。观察组大鼠胃黏膜层炎性细胞减少，平滑、肉芽的增生，有新生血管、固有膜上有新生修复的腺体，腺体的再生变得有规模。见图1～13。

表2 蒙药熊胆及主要成分对大鼠血清5-HT，AngⅡ，VEGF的影响

注：与空白组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与奥美拉唑组比较，▲P>0.05

3 讨论

胃溃疡疾病在临床上属于常见病，出血是胃溃疡最常见的并发症。吲哚美辛(消炎痛)是易致胃溃疡药品中激素替代品类的一种，对胃黏膜有直接的损害作用，可引起胃炎、浅表溃疡、急性胃溃疡、十二指肠炎、胃肠黏膜糜烂而致出血，甚至穿孔。乙醇致大鼠胃溃疡模型由19世纪Beaumont就已发现过度饮酒对胃黏膜有明显损害作用[4]。乙醇浓度越高，乙醇灌胃后引起实验动物胃黏膜上皮细胞的变性、坏死以及间质血管瘀血损伤会逐渐加重。乙醇可溶解脂肪的化合物，破坏胃黏膜屏障的脂蛋白层，保护性物质减少引起黏膜细胞损伤；乙醇可引起黏膜下血管内皮损伤，血管扩张、黏膜下出血等改变。阳性对照组药奥美拉唑适用于胃溃疡十二指肠溃疡应激性溃疡返流性食管炎和卓-艾综合征(胃泌素瘤)，静脉注射可用于消化性溃疡急性出血的治疗。

现代医学认为的止血药作用有收缩血管、降低毛细血管通透性，激活凝血因子，促进血小板生成黏附聚集，抗纤维蛋白溶解等主要4种。机体正常止血与凝血机制有赖于血管壁、血小板、凝血因子、抗凝因子、纤容系统以及他们之间的生理性调解和平衡[5]。

本研究中我们通过观察蒙药熊胆及主要成分对大鼠血小板、血清5-HT、AngⅡ及VEGF的影响初步了解到治疗胃溃疡出血性模型大鼠的作用机制。5-HT又称血清素，其活性部分是吲哚胺。它广泛存在于脑、血小板、胃等组织中，是较强的平滑肌和血管收缩剂。在血小板中含量较高，血小板破裂释放后参与血管收缩等效益。促血管生成素(Ang)家族是近年来发现的与血管生成及血管成熟有关的因子，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种多肤类激素，是肾素-血管紧张素系统的一种主要活性成分，以往仅被作为一种缩血管物质，目前己有很多试验结果提示AngⅡ诱导的血管生成的作用机制可能是通过AT1R增加VEGF的产生，上调Ang-2的表达实现的[6-9]。VEGF是一种特异作用于血管内皮细胞，并能促进其有丝分裂的糖蛋白，能直接刺激血管内皮细胞的增殖作用，同时VEGF能增加血管通透能力，有利于血浆纤维蛋白外渗，进而促进血管生成达到止血目的。此外VEGF的促血管生成作用也有积极作用的一面，其在组织修复方面也有积极的作用。目前大量研究也证实VEGF在溃疡修复中对溃疡基底肉芽组织生长和新血管形成起到了重要的促进作用。说明VEGF确实参与了胃溃疡的愈合过程，也进一步表明胃溃疡愈合过程中需要形成微血管以便输送氧和营养物质等，而VEGF可能在此过程中起了重要作用[10]。通过本实验研究发现，蒙药熊胆及主要成分UDCA、TUDCA能显著提高血小板计数及降低血清5-HT、AngⅡ及VEGF水平，与模型组比较，差异有统计学意义，而CA作用较弱，表明蒙药熊胆及主要成分UDCA、TUDCA是通过提高血小板计数、促进血管收缩而发挥止血作用。是降低毛细血管的通透性从而缩短凝血时间，或者直接作用于血管平滑肌，收缩毛细血管、小动脉、小静脉，减少内脏血流量，促进血管破损处的血凝过程并形成凝块，有利于血浆纤维蛋白外渗，进而促进血管生成达到止血作用。熊胆的主要成分UDCA、TUDCA的这种作用与熊胆基本相似，提示蒙药熊胆的这种止血作用的主要成分为UDCA和TUDCA。本研究结果对于熊胆的科学、合理应用及从熊胆开发新药提供科学依据。

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