银屑病动物模型研究进展

张同梅，王 刚

银屑病是一种主要由T淋巴细胞介导的慢性炎症性皮肤病，典型皮损表现为境界清楚的浸润性红斑和鳞屑。银屑病的发病是遗传、免疫及复杂环境因素相互作用的结果[1]，其复杂的发病机制至今尚未完全阐明。在疾病的发病机制和临床前研究中，动物模型是必不可少的一项工具，而银屑病却是人类所特有的疾病，一般不发生在动物中。迄今发现的少量自发性突变小鼠如鳞片状皮肤突变鼠（Ttc7fsn/Ttc7fsn突变鼠）[2]、慢性增生性皮炎突变鼠（cpdm/cpdm突变鼠）[3]，虽然具有类似人类银屑病的丘疹、鳞屑或红斑表现，但它们的皮损组织中均缺少T淋巴细胞浸润，并且环孢素（cyclosporin A，CsA）或卡泊三醇等药物对其无明显疗效，这些与人类银屑病特征不符合。生物医学动物模型如雌鼠阴道上皮模型、小鼠尾部鳞片模型等，因其不具备银屑病炎症特征，近年来运用也逐渐减少。缺乏合适的动物模型，为银屑病的基础研究和临床前研究带来了一定阻碍。近30年以来，研究者们构建出了多种不同类型的银屑病或“银屑病样”动物模型，这些模型都可在一定程度上模拟人类银屑病的某些特征。现有的应用较广泛的动物模型主要有4大类，包括急性炎症模型、基因工程模型、异体移植模型和中医特定证型动物模型。借助这些动物模型，对银屑病的发病机制有了更进一步的了解，并在此基础上研发了全新的治疗药物。本文旨在对现有的银屑病动物模型做一综述，为银屑病动物水平的研究提供参考。

1 急性炎症动物模型

银屑病急性炎症动物模型包括药物诱导模型和皮肤屏障破坏模型。药物诱导的方式包括局部外用、真皮内注射和口服。常用的局部外用诱导药物有咪喹莫特（imiquimod，IMQ）[4]、普萘洛尔[5]、12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA）[6]、噁唑酮[7]等。其中IMQ诱导的小鼠模型应用最为广泛，其不仅较好地模拟了银屑病样的皮损表现，也一定程度地存在与银屑病相似的固有免疫和获得性免疫紊乱。真皮内注射促炎细胞因子如白细胞介素（IL）-23[8]或抗原（如来源于酿酒酵母菌的甘露聚糖）[9]等，以及口服普萘洛尔[10]也可以诱导与银屑病相似的皮肤炎症和增生。皮肤屏障破坏模型是通过机械外力破坏动物皮肤屏障，如反复贴撕胶带以剥离皮肤角质层[11]，可用来模拟银屑病的屏障失衡状态。

急性炎症模型相比于其他动物模型，具有花费少、省时、省力等优点。这些诱导药物不仅容易获取，而且可以刺激多种遗传背景的小鼠产生皮肤炎症反应，并可以根据研究需要，选取特定周龄的小鼠、在特定时间段来诱导银屑病表型，为研究者们带来极大的便利。然而，急性炎症模型也有其局限性，最主要的局限性就在于这种用药物诱发的皮肤炎症是非特异性的，不只在银屑病中，在其他疾病如系统性红斑狼疮、特应性皮炎等皮损中也有类似的炎症表现。如TPA诱导的小鼠模型还被用于急性刺激性皮炎[12]，IMQ诱导的皮肤炎症模型还被用于系统性红斑狼疮的研究[13]，这些疾病的发病机制均与银屑病不同。其次，急性炎症模型虽然应用广泛，但在构建模型的过程中，普遍缺乏标准化的操作方案，不同实验室、不同操作者在给药的频率、持续时间、药物厂家、药物剂量或浓度、动物饲养条件、动物遗传背景、给药部位等方面均可能不同，这些差异限制了研究的可重复性。如IMQ诱导的银屑病模型，由于不同IMQ产品所用的基质媒介不同，局部外用IMQ会产生不同的皮肤表型[14]，而给小鼠口服IMQ则会诱导出一种强烈的系统性炎症反应[15]。最后，急性炎症模型只适用于短期研究，并不能完全反映银屑病患者的慢性炎症状态。

2 基因工程动物模型

基因工程动物模型是采用基因编辑技术，使小鼠体内某种特定基因过表达或敲除。传统的基因工程小鼠，即转基因小鼠，采用同源重组的方法，对小鼠胚胎干细胞进行基因编辑，再使其发育成完整的个体，通过对该个体后代进行筛选，培育出携带修饰基因的纯合子小鼠，这种小鼠在出生时其全身所有类型细胞即已经具有目的基因修饰。如整体敲除IL-1受体拮抗蛋白的IL1RN-/-小鼠[16]，在其皮肤和耳郭自发性产生炎症反应，伴有表皮增厚与角化不全；CD18缺陷小鼠，其自发产生的银屑病样表型，用抗CD4+T淋巴细胞的抗体治疗有效，而抗CD8+T淋巴细胞抗体无效[17]。基因整体敲除鼠的主要优点在于其具有单一基因的缺失，这为在体研究特定基因缺陷的效应及其遗传和分子机制提供了便利，在人类疾病的病因学研究中有一定运用前景。该类模型的局限性在于其相对昂贵的花费，以及需要大量时间和人力，并且往往出现出生前死亡。此外，全身单一基因的表达改变并不能反映人体不同组织中的基因表达差异，也不能代表复杂的多基因相关疾病如银屑病的遗传背景。

随着基因工程技术的发展，研究者们利用Cre/loxP（cyclization recombination enzyme/locus of X-over P1）系统，配合基因表达调节剂（如四环素、多西环素、他莫昔芬等），构建出了具有组织特异性的条件性转基因小鼠[18,19]。利用Cre重组酶能介导两个loxP位点之间序列特异性重组或删除的特点，分别构建2种转基因小鼠，一种小鼠的目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列，而Cre重组酶则被置于另一种小鼠组织特异性基因，如角蛋白（keratin，KRT）5、14等的启动子调控之下，这两种小鼠交配产生的后代中，同时含有上述两种基因型的小鼠，就实现了目的基因在某一特定组织内被敲除。同理，对目的基因进行过表达，则需要构建含有过表达目的基因的小鼠，只是在该目的基因与启动子之间含有一段翻译终止序列，使得导入的目的基因不表达，将两个loxP位点分别置于这段翻译终止序列两端，当该小鼠与Cre小鼠进行交配，其后代具有两种基因型的小鼠中，Cre重组酶作用于翻译终止序列，使得目的基因得以表达。再配合基因表达诱导剂（如四环素、多西环素、他莫昔芬等），则可以对目的基因的表达时间进行调控。基因过表达的条件性转基因小鼠，主要针对在银屑病发病中起关键作用的基因，如在基底层角质形成细胞中组成性激活信号转导和转录活化蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，Stat3） 通路的KRT5-Stat3小鼠模型[11]，在表皮中过表达转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1的KRT5-TGF-B1小鼠模型[20]，在基底层过表达生长因子家族基因的血管内皮生长因子A （vascular endothelial growth factor A，KRT14-Vegf） 小 鼠[21]、角质形成细胞（keratinocyte，KC）-血管生成素受体（Tie2）小鼠[22]，在表皮中过表达细胞因子的外皮蛋白（involucrin，IVL）-干扰素（interferon，IFN）-γ小鼠[23]、K5-IL-17C小鼠[24]等，这些小鼠模型均能自发产生或通过调节剂诱导产生银屑病样表型，在外观与皮肤炎症模式上均与人类银屑病有不同程度的相似性。一些组织特异性敲除鼠也能出现银屑病样表型，如在表皮中敲除激活蛋白-1（activator protein1，AP-1）家族基因的KRT5-JunB/Jun小鼠，具有与银屑病相似的皮肤炎症表现和严重的关节炎[25]；在表皮中敲除核因子 κB (nuclear factor κB， NF-κB)通路相关基因如KRT14-IKKβ小鼠，表皮中IκB激酶β（inhibitor kappa B kinaseβ，IKKβ）的缺失导致 NF-κB活化，产生表皮增厚、分化异常和严重的皮肤炎症表现[26]。理论上讲，采用Cre/loxP系统，可以对动物体任何发育阶段的任何组织或细胞中的任一基因进行条件性遗传修饰，具有非常广阔的应用前景。组织特异性的条件性转基因小鼠的优点在于实现了目的基因在空间和时间上的可控修饰，可以更准确的模拟人类疾病状态，为研究目的基因在特定组织或细胞中的功能和作用机制提供便利。并且，与整体修饰模型相比，由基因修饰导致的出生前死亡也大大降低。该模型局限性在于它价格更昂贵，建模耗时更长，并且对两种以上的基因进行了修饰，可能不仅仅影响了目的基因的表达，此外，很多条件性转基因模型需要使用基因调节剂如多西环素来调节表达，而调节剂的摄入方式或小鼠摄食行为的差异，可能会导致实验结果出现混杂因素和偏差。

此外，一些基因工程小鼠模型的基因修饰与银屑病的基因表达模式相反，比如K17-/-小鼠[27]，这些动物模型本身并不出现银屑病样表型，但被修饰的目的基因在银屑病发病过程中起了重要作用，利用这些模型可以深入研究发病机制，并探索这些目的基因作为治疗靶点的潜在价值。

近5年出现的一项新的基因编辑技术——规律成簇的间隔短回文重复序列与其相关蛋白9（clustered regularly interspaced palindromic repeats -associated protein 9，CRISPR/Cas 9）系统，也开始被用于皮肤病学研究[28]，并且已被用于构建转基因小鼠模型来进行银屑病的临床前研究[29]。这项技术的优点是能够对基因进行精确编辑，与其他转基因动物模型相比，在构建模型的时间上大大缩短。这种模型的局限性在于它难以预测的脱靶效应，会造成研究结果的不确定性以及工作量的增加。尽管CRISPR/Cas 9系统在皮肤科领域的应用尚不多，但因其强大的基因编辑能力，使其具有广阔的应用前景。

3 异体移植动物模型

异体移植模型包括异种移植模型和同种不同品系小鼠间移植模型。后者主要是指给免疫缺陷小鼠静脉注射不同品系小鼠主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）不相容的免疫细胞进行免疫重建，如给癌症研究学院（Institute of Cancer Research，ICR）来源的重症联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠静脉注射来源于BalB/C小鼠的幼稚CD4+T淋巴细胞（CD45RBhi），4～8周后小鼠皮肤会出现银屑病样表型，包括表皮增厚、角化过度、角化不全、炎性细胞浸润等，银屑病相关细胞因子IFN-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6等也有升高，该模型采用CsA和紫外线治疗有效[30]。但是注射CD4+记忆性/效应T淋巴细胞（CD45RBlo），却不会出现银屑病表型，2种细胞一起注射，只能表现出轻度的表型[30]。该模型的优点是可部分模拟银屑病T淋巴细胞免疫模式，但因种间差异的存在，对研究结果的解读有一定局限性。

异种移植银屑病动物模型是将人体组织或细胞移植给免疫缺陷小鼠，使移植物维持或产生银屑病样表型。最常用到的小鼠受体有裸鼠、SCID小鼠和AGR129小鼠[31]。裸鼠是T淋巴细胞免疫缺陷鼠，其胸腺退化不能产生成熟的T淋巴细胞，也无法产生T淋巴细胞依赖性的抗体，对移植物无排斥反应。在裸鼠中移植的银屑病皮损（psoriasis plaque skin，PP）可以保持2个月不改变银屑病表型[32]。但宿主小鼠仍有产生T淋巴细胞非依赖性抗体的能力和正常的自然杀伤（NK）细胞功能，不利于移植物长期保持活性。

SCID小鼠是体液和细胞免疫双重缺陷小鼠，但仍有正常活性的NK细胞，尽管对实体组织移植物具有很好的接受度，但是单细胞悬液的移植却能被迅速识别并消灭[33]。研究者对SCID小鼠移植银屑病患者的非皮损组织（psoriasis non-lesional skin，PN）注射大量来源于供体的血液免疫细胞，发现PN逐渐转变为PP，而来源于正常人的皮肤组织（normal nonpsoriasis control，NN）并没有发生转变[34]。这种模型已被用于临床前研究，用于评估新药物的疗效[35]。

AGR129小鼠具有三重免疫缺陷，同时缺失T淋巴细胞、B淋巴细胞和成熟的NK细胞。将PN组织移植到AGR小鼠背部，6～8周后PN自发性的转变为PP，而NN并没有发生转变，给予异种移植小鼠模型静脉注射抗CD3抗体进行治疗，则可以阻止PN向PP转变[36]，这种自发性异体移植模型提示，PN中定植的T淋巴细胞（尤其是CD8+T淋巴细胞）在移植物中扩增起了关键性作用，而受体小鼠的NK细胞可能会妨碍移植物中定植T淋巴细胞的扩增，当NK细胞缺陷时，供体的免疫细胞尤其是T淋巴细胞更容易诱导PN向PP转变[37]。

异种移植模型的主要优点在于采用了人体来源的组织，最接近人类疾病的免疫和遗传基础，在临床前研究中，对于观察新药物的疗效、代谢、不良反应等均有很大优势[38]。然而，构建这种模型需要较大量的供体组织，供体取材后需要立即进行移植以防止移植物缺血，对操作技术要求较高。另外，由于移植物的质量参差不齐和宿主小鼠体内缺乏与银屑病患者相似的内环境（如缺乏银屑病相关细胞因子的高表达），也可能导致研究结果出现偏差，这些局限性均限制了异种移植模型在银屑病研究中的广泛应用。

4 中医特定证型动物模型

随着银屑病的中医药治疗研究发展，中医研究者通过控制豚鼠或小鼠饲养环境的温度、湿度、饮食等，配合喂服中药、外用普萘洛尔等，构建出可模拟某一特定证型银屑病的动物模型，根据其辨证分型分为血瘀型[39]、脾虚型[40]、湿热型[41]等。

中医特定证型动物模型在出现银屑病样皮损的基础上，还会出现与相应证型银屑病患者相似的伴随症状，如血瘀型动物模型伴随体质量减轻、肤色变暗等[39]，脾虚型动物模型伴随少食、活动减少等[40]，湿热型动物模型伴有嗜睡、肛温升高等[41]，这些动物模型能较好的模拟银屑病患者的整体状态，为银屑病中医药治疗的机制、药效学研究奠定了良好的基础。但因银屑病中医药基础研究者相对较少，研究平台暂局限于国内，缺乏国际认可，限制了其广泛应用。

5 总结

人类与模型动物之间有着显著的细胞学、解剖学差异，两者的免疫系统也有所不同，如小鼠T淋巴细胞上缺乏MHCⅡ类分子、具有人类所没有的CD8+树突状细胞等[42]。此外模式小鼠的近亲繁殖方式，使其缺乏人类的遗传多样性。这些种间差异的存在，提醒研究者在小鼠中观察到的疾病表型或药物疗效可能并不表示在人类中也会有相同的结果。

各种模型构建时，由于不同实验室操作程序、不同模式动物的遗传背景、动物饲养条件以及关键指标评价体系的差异，造成了研究结果的混杂和偏差。如急性炎症动物模型的构建过程中，诱发药物的浓度、剂量、处理时间、处理方式（外用或注射）等变量因素的差异，降低了研究结果的可重复性。因此需要建立一套标准化的操作程序和评估体系，并加入适当的验证研究。比如对建模过程的每一步操作进行量化，评估组织学特征时采取客观治疗（如测量表皮厚度），将研究结果在其他类型的动物模型上重复验证，或采用已知有效的治疗药物（如CsA、TNF-α抑制剂）来帮助验证等。

现有的银屑病动物模型在银屑病研究中发挥了必不可少的作用，极大的促进了对银屑病发病机制的探索及开发新的治疗药物。尽管现有的动物模型有很多优点，仍然没有一种模型能完全模拟人类银屑病的全部特征，研究者须根据课题设计、实验经费、研究平台等因素合理选择动物模型。