鱼藤酮致帕金森病的机制研究进展

李慧珍,牛丕业,陈 丽,宋冬梅,张媛媛,马俊香

(首都医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系，环境毒理学北京市重点实验室,北京 100069;*通讯作者,E-mail:majxiang83@ccmu.edu.cn)

帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,主要症状是震颤,僵硬,运动迟缓,步态异常。主要病理改变是黑质致密部多巴胺(dopamine,DA)神经元退行性变和被称为路易氏小体(Lewy body,LB)的细胞包含物的形成,黑质神经元减少和不同程度的胶质细胞增生。研究显示,90%以上的PD患者的致病因素都与环境污染物密切相关,其中杀虫剂鱼藤酮接触尤为明显。

鱼藤酮是一种植物性杀虫剂,属于异黄酮家族的一员,主要存在于醉鱼豆属植物毛鱼藤的植物根茎,研究表明,用鱼藤酮染毒可诱发动物出现类似PD的典型临床症状:运动迟缓、僵直、震颤;用鱼藤染毒小鼠在黑质纹状体的细胞中也可出现α突触蛋白(α-synuclein)聚集和DA神经元的丢失现象[1],而α-synuclein的异常堆积是LB的主要组成成分。这些研究提示鱼藤酮可通过引起α-synuclein沉积或聚集和黑质DA神经元的丢失,进而导致PD疾病的发生,但具体机制尚不清楚。本文从鱼藤酮的理化性质、毒性作用及其导致PD的可能机制进行简单综述,为PD的治疗提供理论参考。

1 鱼藤酮的理化性质及其毒性作用

鱼藤酮是一种杀虫剂,又被称为毒鱼藤,分子式为C23H22O6,无色六角板状晶体,存在于鱼藤属植物根皮部,脂溶性很强。难溶于水,易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂。可以不借助任何载体蛋白直接穿透血脑屏障和细胞膜。其主要生物学效应是抑制细胞呼吸链NADH脱氢酶(即复合物I,complex I)的活性,影响细胞呼吸链对氧的利用,造成细胞内呼吸抑制性缺氧。

2 鱼藤酮导致帕金森病的机制

PD患者的一个显著病理特点是在黑质和其他脑干内存在LB。α-synuclein的异常积累是LB的主要成分,也是直接导致DA神经元变性坏死的主要原因,但α-synuclein在细胞质中的异常聚集机制尚不清楚。细胞降解途径如自噬的异常,可能使细胞更容易形成因α-synuclein的异常积累或其他未折叠或错误折叠蛋白的聚集而引起的蛋白质聚集体。自噬在PD中的作用仍存在争议,自噬功能的异常与α-synuclein的聚集和毒性的关系尚需要进一步研究[2]。在星形胶质细胞系中过表达α-synuclein可以促进细胞自噬抑制和细胞凋亡。研究发现,鱼藤酮、百草枯等多种杀虫剂都可以直接和α-synuclein作用,促进其聚集[1],但具体机制不清。此外,研究发现,鱼藤酮可能通过神经炎症而引发PD发病[3,4]。因此本文将从细胞凋亡、细胞自噬和神经炎症反应三个方面介绍鱼藤酮致PD的可能机制。

2.1 细胞凋亡

细胞凋亡(apoptosis)是神经元细胞退变或丢失的主要途径之一。细胞凋亡又称细胞程序性死亡,是多细胞生物在生长发育过程中调控机体发育,维持内环境稳态出现的主动死亡的过程。鱼藤酮是一种细胞毒性物质,可选择性地阻断线粒体呼吸链复合物I,使呼吸链不能将NADH氧化为NAD、生成的ATP减少,质子传递障碍,进而增加细胞中活性氧的含量,导致脂质过氧化和自由基形成[5],自由基含量的升高可以促进细胞凋亡。鱼藤酮可以通过直接和间接两种方式促进细胞凋亡。用鱼藤酮处理PC12细胞,发现鱼藤酮可通过诱导过氧化氢酶表达,增加细胞内ROS的水平,阻断mTOR介导的S6K-1和4E-BP1/eIF4E通路,导致神经细胞凋亡[6]。研究发现,降低细胞中过氧化氢酶的含量可以抑制鱼藤酮引起的细胞凋亡,提示H2O2参与了细胞凋亡。鱼藤酮也可能通过提高ROS含量,促进钙离子内流间接地促进细胞凋亡。褪黑素可以阻止与氧化应激相关的DA神经元变性[7],Swamkar等[8]发现褪黑素虽然可以清除ROS,却不能阻断鱼藤酮引起的细胞核和DNA的损伤,因此鱼藤酮也可能通过诱导ROS产生,进而提高细胞内钙离子的浓度,从而引起细胞凋亡。除了ROS和细胞内钙离子浓度,鱼藤酮可能通过减少ATP的生成降低线粒体膜电位(ΔΨm),改变膜的通透性,位于线粒体膜间隙的细胞色素c进入胞浆[9,10],从而引发细胞的凋亡通路。综上所述,细胞内ROS、钙离子浓度增高、ΔΨm改变在鱼藤酮诱导细胞凋亡过程中起着重要的作用。

2.2 细胞自噬

细胞自噬(autophagy)是生物体内清除功能异常的细胞器、被氧化的脂类、错误折叠的蛋白质等有害大分子物质的重要途径,越来越多的研究表明自噬失调可能与神经退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森症(Parkinson’s disease,PD)等相关[5,6]。被氧化的脂类、错误折叠的蛋白质等若不能被及时有效地清除,就会造成积聚,可引起神经细胞功能丧失、乃至死亡,是导致神经退行性变的主要原因[7]。根据底物进入溶酶体的方式不同将自噬方式分为三种：大自噬(macroautophagy),小自噬(microautophagy),分子伴侣介导的自噬(CMA)[11]。大自噬是最主要的自噬方式,主要是由双层膜包裹被部分胞质和细胞内需降解的细胞器,蛋白质等物质形成自噬体,运输到溶酶体被降解。大自噬中有一种特殊方式的自噬方式即为线粒体自噬。小自噬是不形成自噬体,溶酶体膜内陷,被降解物直接被溶酶体降解。CMA降解特定的蛋白质,最终也是在溶酶体内完成降解[11-13]。

2.2.1 分子伴侣自噬与大自噬 鱼藤酮通过阻断α-synuclein的降解途径使α-synuclein聚集[14]。野生型α-synuclein的降解主要通过CMA途径或者大自噬途径[15],当这两种降解途径被阻断时,α-synuclein就会聚集。鱼藤酮可以通过影响上述两种途径导致帕金森病的发生。

研究发现,鱼藤酮可以通过降低Hsc70表达程度阻断CMA过程[16],Hsc70参与CMA降解蛋白质的过程,但鱼藤酮导致Hsc70水平下降的机制尚不清楚。可能与线粒体功能受抑制有关。其次发现,提高自噬水平可以缓解鱼藤酮导致的PD症状[17-19],证明自噬参与了帕金森的发病过程。在实验中发现被鱼藤酮处理过的PC12细胞中与细胞自噬有关的蛋白质LC3和p62水平都有所上升[19,20],LC3通常用来检测细胞的自噬水平。LC3升高表明自噬水平提高,p62作为自噬的底物通常用来检验自噬流的完整性,p62含量升高说明自噬流的不完整性[21],自噬流不完整使α-synuclein的降解受限,同时α-synuclein聚集反过来也会阻断自噬流形成恶性循环严重影响细胞的正常功能,最终DA神经元受损导致帕金森病的发生。

虽然自噬流被阻断可以很好地解释DA神经元损伤,但也有实验发现p62含量降低,同时发现自噬水平的提高是有时间依存性的,处理前期自噬水平提高,后期自噬水平有所下降同时发现出现细胞凋亡[22]。出现结果差异的原因可能是检测时间不同,用鱼藤酮处理前期α-synuclein开始堆积,细胞通过提高自噬水平来降解堆积的蛋白质维持细胞正常水平,LC3升高,p62的含量下降,随着时间的增长α-synuclein的堆积超过细胞的负荷,凋亡程序被启动,因此提高自噬水平的预处理可以减轻鱼藤酮对细胞的损伤[23]。鱼藤酮损伤自噬过程可能与线粒体损伤,膜通透性改变导致胞浆Ca2+升高有关[14],有文献证明钙离子参与了自噬的调节过程[24]。

2.2.2 线粒体自噬 在上述鱼藤酮的理化性质及其毒性作用中已经提到,鱼藤酮可抑制细胞呼吸链complex I的活性,减少ATP的生成,降低ΔΨm,增加线粒体膜的通透性[9],损伤线粒体,诱导细胞自噬和线粒体自噬的发生[25]。线粒体自噬是大自噬的一种,能及时清除细胞内受损的线粒体进而维持细胞的正常功能。鱼藤酮诱导线粒体自噬发生的机制有Parkin途径和非Parkin途径,非Parkin途径是指研究发现鱼藤酮可通过诱导心磷脂(CL)从线粒体内膜到线粒体外膜的转位同时LC3在线粒体外膜上与CL结合,导致线粒体自噬的发生。CL是线粒体内膜上的特有脂类,在稳定线粒体呼吸链复合物和线粒体嵴的作用方面发挥重要的作用,CL和LC3结合在线粒体自噬中发挥重要作用[26]。用RNAi降低CL,可降低鱼藤酮毒染的细胞中线粒体自噬水平。有趣的是,在鱼藤酮处理的细胞中p62、Parkin和PINK1含量并无明显变化,提示鱼藤酮可能不是通过Parkin途径诱导线粒体自噬[27]。但Alvin等[28]也发现在鱼藤酮处理的小鼠神经细胞中Parkin途径相关的线粒体自噬途径被激活,ROS含量升高在Parkin途径的激活过程中发挥重要作用。综上所述,在鱼藤酮致PD过程中,线粒体自噬可能发挥着重要的作用,但激活线粒体自噬的途径尚存在争议,可能是与细胞种类、观测时间和实验条件等因素有关,因此,在鱼藤酮致PD过程中,线粒体自噬的作用机制尚需要进一步深入的探讨。

2.2.3 溶酶体功能紊乱 不管是CMA、大自噬,还是线粒体自噬,三者的最终通路都是在溶酶体内完成,因此,溶酶体的正常功能对维持自噬的正常水平具有很重要的意义。鱼藤酮不仅可以通过提高胞质Ga2+含量阻断自噬流,还可通过损伤溶酶体阻断自噬。这种损伤作用与ROS含量升高有关,ROS能增加溶酶体膜通透性[27],引起细胞凋亡蛋白酶(cathepsins)的释放和激活,实验中发现cathepsinD从溶酶体到细胞液的重新分布[4],溶酶体中cathepsinD含量减少说明其储存功能下降,溶酶体功能障碍会阻断自噬流[29]。另外还有实验发现鱼藤酮可以通过提高自噬小泡的pH值阻断自噬流。这可能与ATP生成量减少,依赖ATP的酸化过程受到抑制有关。

2.3 神经炎症反应

越来越多的研究发现神经炎症在PD发病机制中起着很重要的作用。鱼藤酮可通过MAPK通路直接激活小神经胶质细胞,进而导致神经元的损伤[30]。小神经胶质细胞是中枢神经系统中的巨噬细胞和抗原呈递细胞,约占成熟大脑胶质细胞总数的10%-15%,活化的小胶质细胞能释放多种炎症因子如TNF-α、IL-1β,这些炎症因子能直接或间接损伤神经细胞。实验发现鱼藤酮能活化激酶MAPK,引起转录因子NF-κB从细胞质到细胞核的转位。可能的机制是:鱼藤酮提高活性氧水平,活性氧活化MAPK[31],从而激活NF-κB通路,进而激活小胶质细胞[32]。而Heather等[33]却发现在LPS(脂多糖)和鱼藤酮处理的小胶质细胞中,用LPS处理的实验组出现了TNF-α、IL-1β水平升高、小胶质细胞形态学改变等现象,但用鱼藤酮处理的实验组并没有出现上述炎症因子增多等现象,提示鱼藤酮可能不能直接活化小胶质细胞,该观点在Gao等[34]的研究中也得到了证实。对于上述两种截然不同的结论目前尚没有一个合理的解释[35]。

3 展望

综上所述,鱼藤酮可能主要从细胞凋亡、细胞自噬、神经炎症反应方面导致PD的发生,但目前关于鱼藤酮导致PD的发病机制还不是十分清晰,了解该机制对治疗鱼藤酮导致的DA神经元损伤和丢失具有十分重要的意义,同时越来越多的研究表明自噬和神经炎症参与了帕金森发病过程,因此,如何特异性地提高神经细胞的自噬能力和抑制神经炎症,为有效治疗PD提供可能的方向。