二苯乙烯苷对APP/PS1小鼠老年斑形成和炎症反应的影响①

黄蕊，杨翠翠，李林，张兰

首都医科大学宣武医院药物研究室，北京市神经药物工程研究中心，神经变性病教育部重点实验室，北京市100053

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种以认知功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，现已成为严重威胁老年人健康的四大疾病之一。其主要特征是β淀粉样蛋白(beta amyloid,Aβ)沉积和神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)[1]。目前AD的发病机制尚未完全明确，包括氧化、压力和炎症等多个致病因素[2-3]，但越来越多的证据表明，神经炎症是AD发病的一个重要因素。在AD发病过程中，炎症反应是神经元丢失的重要原因之一[4-6]。由于过量Aβ聚集和纤维化，小胶质细胞和星形胶质细胞被激活，炎症因子大量释放，诱发过度炎症反应，导致突触和神经元大量损伤和丢失[7]。

二苯乙烯苷(2,3,5,4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside,TSG)是中药何首乌的主要有效成分和标志成分，具有抗衰老、神经保护、降血脂以及抗动脉硬化等作用[8]。多奈哌齐是第二代高选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂，主要用于治疗轻度和中度AD。课题组前期研究显示，TSG能够改善不同月龄APP转基因小鼠的学习记忆障碍[9]，并能改善β淀粉样肽致痴呆模型小鼠的学习记忆，增强胆碱能神经功能[10]。本实验用APPswe/PS1dE9双转基因小鼠为动物模型，以多奈哌齐作为阳性对照药，探讨TSG对Aβ沉积以及胶质细胞过度活化的影响，从而进一步证实TSG对AD的潜在治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级APP/PS1双转基因阳性小鼠64只及野生型(wild type,WT)小鼠32只，体质量30～35 g，购自南京大学模式动物所，许可证号SCXK(苏)2015-0001。小鼠分笼饲养于首都医科大学宣武医院实验动物室屏障环境，12 h光照，自由进食和进水，室温20～25℃，湿度50%～70%。

1.2 主要药品、试剂及仪器

TSG：本实验室从何首乌中提取，纯度85%，实验中采用干粉剂，溶解于蒸馏水，制成药液。多奈哌齐(国药准字H20050978，批号1502016)：卫材(中国)药业有限公司。刚果红染液(货号MST-8013)：上海迈新生物技术有限公司。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)(货号ZA-0529)、一抗山羊血清(货号ZLI-9021)、一抗稀释液(货号ZLI-9030)、生物素标记的山羊抗兔IgG(货号ZB-2010)、辣根酶标记链酶卵白素(货号ZB-2404)、DAB显色试剂盒(货号ZLI-9018)：北京中杉金桥生物技术有限公司。Aβ一抗(货号2454)：美国CELL SIGNALINGTECHNOLOGY公司。离子钙结合蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)一抗(货号 019-19741)：日本WAKO公司。

BH-2光学显微镜：日本OLYMPUS公司。BS210S电子天平：北京赛多利斯天平有限公司。A78910100冰冻切片机：美国THERMO公司。新物体识别设备：本室自制。

1.3 动物分组及给药

64只5月龄APP/PS1小鼠，按随机数字表分为4组，每组16只。每天模型组予蒸馏水10 ml/kg灌胃；TSG低剂量组予TSG 0.05 g/kg灌胃；TSG高剂量组予TSG 0.1 g/kg灌胃；多奈哌齐组予多奈哌齐0.001 g/kg灌胃。

32只5月龄WT小鼠，按随机数字表分为两组，每组16只。每天正常对照组予蒸馏水10 ml/kg灌胃；TSG高剂量WT组予TSG 0.1 g/kg灌胃。

各组给药时长均为7个月，至小鼠12月龄。

1.4 新物体识别实验

给药结束后，各组行新物体识别实验。实验第1天，将小鼠放于475×350×200 mm塑料空盒中自由探索10 min。第2天，在盒子里放置两个相同物体，秒表记录小鼠10 min内对这两个物体的探索时间，小鼠鼻子靠近物体1 cm距离内视为对物体进行探索。第3天，将其中一个物体换成新物体，秒表记录小鼠在10 min内对新旧物体的探索时间。计算识别指数(discrimination index,DI)。

1.5 取材及检测

新物体识别实验后，小鼠以10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，开胸，剪开心包膜，暴露心脏和主动脉弓。用7号钝头针头插入左心室至主动脉弓，剪开右心耳，灌注0.9%氯化钠注射液100 ml，待右心耳流出液无色透明时，用4%多聚甲醛(pH=7.4)100 ml灌注固定至小鼠四肢僵直。灌注2 h后开颅取脑，固定于后固定液中；1周后冰冻切片，冠状位，片厚30 μm，连续切片。脑片置PBST缓冲液中，4℃储存。

1.5.1 刚果红染色

每组3只，每只取3张皮质及海马脑组织切片，捞至载玻片上，晾干，滴加饱和刚果红染液染色10 min，滴加分化液约20 s，镜下控制，水洗5 min；苏木精浅染约10 s。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。应用Image J软件计数，以模型组斑块数为1进行标准化(各组数据/模型组均值)。

1.5.2 免疫组化染色

每组3只，每只取3张脑片，捞至载玻片上，晾干。枸橼酸缓冲液沸水煮10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，3%H2O2室温孵育10 min；PBS冲洗3次，每次5 min，10%山羊血清(PBST稀释)室温孵育30 min。弃去血清，滴加一抗及稀释液，Aβ稀释度为1∶200，Iba1稀释度为1∶500，GFAP稀释度为1∶200，4℃过夜。次日37℃复温30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加生物素标记山羊抗兔IgG(PBST稀释，1∶100)，37℃孵育2 h；PBS冲洗3次，每次5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素(PBST稀释，1∶100)，37℃孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min；DAB显色液显色，镜下控制，并用自来水终止显色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。Aβ、Iba1和GFAP染色阳性面积用Image-pro Plus 6.0软件进行统计，以模型组面积为1，进行标准化(各组数据/模型组均值)。

1.6 统计学分析

数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料用(xˉ±σXˉ)表示，多组间样本比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA)。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 新物体识别实验

与正常对照组相比，模型组DI降低(P＜0.05)；与模型组相比，各治疗组DI均明显升高(P＜0.01)。见表1。

表1 各组新物体识别实验DI比较

2.2 刚果红染色

与正常对照组相比，模型组皮层及海马均散在分布大量砖红色斑块(P＜0.001)，与AD疾病细胞外斑块沉积病理改变一致。与模型组相比，各治疗组脑内斑块沉积均有不同程度减少(P＜0.05)。见图1～图4。

2.3 Aβ40/42

与正常对照组相比，模型组皮层及海马出现大量褐色团块状Aβ40/42沉积(P＜0.001)。与模型组相比，各治疗组小鼠皮层及海马Aβ40/42沉积均有不同程度减少(P＜0.05)。见图5～图8。

2.4 Iba-1和GFAP

正常对照组与TSG高剂量WT组海马小胶质细胞和星形胶质细胞形态正常且分布均匀，模型组海马染色呈现团块状分布(活化的小胶质细胞和星形胶质细胞)，Iba-1和GFAP阳性面积显著增加(P＜0.001)。与模型组相比，各治疗组海马部位Iba-1和GFAP阳性面积均有所减少(P＜0.05)。见图9～图12。

图1 各组皮层淀粉样斑块沉积情况比较

图2 各组海马淀粉样斑块沉积情况比较

图3 各组皮层淀粉样斑块沉积(刚果红染色,20×)

图4 各组海马淀粉样斑块沉积(刚果红染色,20×)

图5 各组皮层Aβ40/42沉积情况比较

图6 各组海马Aβ40/42沉积情况比较

图7 各组皮层Aβ40/42沉积(免疫组化染色,20×)

图8 各组海马Aβ40/42沉积(免疫组化染色,20×)

图9 各组海马Iba-1表达情况比较

图10 各组海马GFAP表达情况比较

图11 各组海马Iba-1表达(免疫组化染色,40×)

图12 各组海马GFAP表达(免疫组化染色,40×)

3 讨论

AD的病理生理机制非常复杂，AD脑内病变是一个慢性炎症的观点已被普遍接受。AD脑内慢性炎症反应涉及大量细胞和分子，包括与Aβ沉积和老年斑形成有关的小胶质细胞激活、反应性星形胶质细胞增生，以及炎性细胞因子的表达增加，同时激活细胞内信号转导途径[11-13]。小胶质细胞和星形胶质细胞是胶质细胞的主要类型，反应性胶质细胞与AD中斑块密切相关[14]。

刚果红染色能显示脑内淀粉样斑块沉积，是诊断淀粉样变性最简便易行的方法[15]，也常应用于淀粉样蛋白示踪剂研究[16-17]。本研究显示，12月龄APP/PS1小鼠脑内已经出现大量老年斑；给予TSG后，老年斑数量有所减少；Aβ40/42也显示同样趋势。这印证了Aβ40/42是老年斑的主要成分[18]。Aβ经淀粉样前体蛋白水解产生，并可以被胰岛素降解酶、中性内肽酶等水解酶水解清除[19-20]。

在中枢神经系统中，小胶质细胞约占成年脑细胞的5%～10%[21]。正常生理状态下，小胶质细胞处于抑制免疫应答反应的状态；Aβ可作为始动因素激活小胶质细胞产生炎症反应，过度增殖和活化的小胶质细胞合成和释放大量炎症因子和过氧化物，加重炎症反应强度，最终导致细胞死亡[22-23]。

Iba1是小胶质细胞特异性表达，约17 kDa的钙结合蛋白，在活化的小胶质细胞中表达升高。本研究中12月龄模型小鼠脑内Iba1标记的小胶质细胞过度活化呈团块状，与文献中描述一致[24]，而治疗组脑内小胶质细胞活化程度明显降低。

星形胶质细胞参与神经保护和神经组织损伤后修复过程，约占神经系统细胞总数35%[25]。与小胶质细胞一样，星形胶质细胞暴露于Aβ后释放炎症因子，加剧神经炎症反应。GFAP是星形胶质细胞的主要成分，可标记正常和活化的星形胶质细胞。本研究中12月龄模型小鼠脑内星形胶质细胞过度活化，治疗组星形胶质细胞活化程度明显降低。TSG对小胶质细胞和星形胶质细胞过度活化的抑制，说明TSG的显著抗炎作用。

综上所述，目前认为Aβ引起的神经炎性损伤是AD的重要发病机制之一，小胶质细胞和星形胶质细胞作为主要的免疫细胞参与炎症反应过程。通过7个月给予TSG，12月龄AD模型小鼠学习记忆能力改善，脑内老年斑以及组成老年斑的主要成分Aβ40/42减少，同时小胶质细胞和星形胶质细胞活化被抑制，推测TSG可能通过抑制APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ的形成，减少斑块沉积，进而抑制小胶质细胞活化和反应性星形胶质细胞增生，降低炎症反应，同时改善学习记忆。

本文通过免疫组化染色，直观呈现各组小鼠脑内Aβ40/42沉积、小胶质细胞以及星形胶质细胞的形态，将为进一步研究TSG的抗炎作用机制提供有意义的实验依据。TSG对于Aβ的减低是通过降低Aβ的生成还是增加Aβ的清除，TSG是否通过降低炎症因子发挥其抗炎作用，以上机制目前尚不明确，还需进一步深入研究。

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