代谢工程应用研究进展

刘 震， 董高超， 孙 林， 莫 朕， 夏亚穆

(青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266042)

代谢工程是指利用基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，结合细胞基因调控、代谢调控及生化工程，通过构建新的代谢途径来生产特定目的产物而发展起来的一门应用性学科。二十世纪七十年代开始，随着基因工程的迅猛发展，人们认识到利用重组DNA技术可以改造微生物代谢途径中特定的酶反应，在此基础上1991年首次提出代谢工程的概念。经过二十多年的发展，代谢工程逐渐发展成为一个新的学术领域，其利用重组DNA技术，有目的地操控细胞转录、调控以及酶的功能，改善细胞活性，广泛应用于微生物、植物和动物细胞中，一定程度上改变了人们的生活。外源基因导入是基因工程研究中重要的环节，传统的基因转化方法主要包括载体介导转化和外源基因直接导入两大类。在此期间，其他的一些无选择标记基因的方法如基因打靶和染色体工程应运而生，这更大程度上源于对物种调节再生机制和转化过程机理的了解。更进一步，在染色体特定的区域无选择性标记基因和基因整合可以推进代谢工程的实施。代谢途径的基因修饰是代谢工程实施的重点，常见的策略包括引入目的靶基因、干涉靶基因的表达或对控制生物合成的转录因子进行修饰。锌酯核酸酶是近年来发展起来的定向改变基因组序列的技术，其在植物和微生物中的研究对于新药研发和新品种选育等方面有着广阔的前景。传统沉默策略常常因序列同源性使整个基因序列不表达，锌酯核酸酶和具有转录活性的效应器核酸酶可以由足够的特异性基因组来设计。

1 代谢工程在微生物中的应用

早期，人们利用微生物发酵获得发酵产品，对其开发利用主要集中在筛选高产菌株方面。随着代谢工程的发展，微生物发酵产业朝向目标产物生产的发展。代谢工程基于对细胞代谢网络的研究，控制酶的转录和翻译，一方面人们可以调控微生物代谢通过筛选获得高产菌株，另一方面也可以转入目的基因生产特定的目标产物。

1.1 在微生物药物生产中的应用

很多结构复杂的天然化合物在自然界中含量比较低，很难大量获得，设计微生物代谢生产一些药物和前体药物成为人们研究的重点。与其他高等生物相比，微生物细胞生长繁殖比较快速，并且微生物代谢途径更容易修饰，因此人们可以在细胞水平上进行代谢调控来生产这些药物。该方法最初用于聚酮和肽类化合物的合成中[1]，经过十几年发展，其在药物的合成中得到了广泛的应用。Li等[2]在棒状链霉菌中通过gap1和gap2的基因敲除并且在培养基中加入精氨酸，使链霉菌生产出抗生素克拉维酸。Asadollahi等[3]在酿酒酵母中异源表达植物倍半萜生物合成基因，下调ERG9基因并且在培养基中加入甲硫氨酸，使酿酒酵母菌生产出抗癌药瓦伦烯、抗病毒药荜澄茄醇和抗菌药广藿香醇。2013年，Alonso-Gutierrez等[4]在大肠埃希菌中设计甲羟戊酸途径和柠檬烯合酶表达，使在大肠埃希菌中合成具有抑菌作用的柠檬烯和抗癌药物紫苏醇。2015年，Rodriguez等[5]通过敲除酿酒酵母菌两种丙酮酸脱羧酶基因，并且引入大肠埃希菌莽草酸激酶，使酿酒酵母的香豆酸产量提高了7.9倍。

1.2 在发酵工业原料生产中的应用

微生物发酵是工业原料的重要来源，代谢工程可以有目的地改造工业发酵菌种，使之高效地生产目标产物。在丙酮丁醇梭菌中，丁醇的合成分为两部分，Atsumi等[6]将其控制丁醇合成的基因组转移到大肠埃希菌中，提高了正丁醇的产量。2011年，Yu等[7]通过敲除酪丁酸梭菌的乙酸激酶突变体也提高了丁醇的产量。2013年，Curran等[8]将三步合成途径基因导入酿酒酵母菌中，使得粘康酸第一次在酿酒酵母菌中合成。Runguphan等[9]在酿酒酵母中过表达参与脂肪酸合成的3个基因：乙酰-CoA羧化酶(ACC1)、脂肪酸合酶1(FAS1)和脂肪酸合酶2(FAS2)，增加了酿酒酵母中脂肪酸的产量。

2 代谢工程在植物中的应用

植物在生长、代谢过程中会合成一些对植物体本身生命活动没有明确功能的物质，这些物质称为次级代谢产物，也是天然产物的重要来源。代谢工程可通过基因工程技术改变或构建新的植物代谢途径，以获得有价值的次级代谢产物，其在植物中的应用主要有两方面，一是提高植物源天然产物产量，二是提高农作物产量和营养价值。

2.1 增加植物源天然产物含量

几个世纪以来，植物一直作为活性药物的来源。近年来，统计表明75%的抗菌药物和48.6%的抗癌药物是天然产物或天然产物类似物[10]。其中许多天然药物是通过物种特异性控制复杂的生物合成途径获得的[11]，例如莽草酸途径、非甲羟戊酸途径和甲羟戊酸途径。这些途径合成了包括萜类、生物碱、类黄酮和花青素等许多结构多样的化合物。一般情况下，人们通过分离提取来获得这些结构复杂的化合物，由于植物体内次级代谢产物含量很低，不能满足人们正常需求。随着基因重组技术的发展，人们可以改造植物代谢途径，通过转入或删除某些关键酶基因，促进或抑制该基因表达，包括引入目的靶基因、干涉靶基因的表达或对控制生物合成的转录因子进行修饰等，调控次级代谢产物及含量，解决天然源化合物获取不足问题。Polturak等[12]对甜菜和紫茉莉进行转录组分析，确定了新的甜菜红色素细胞相关P450型基因，将其导入烟草细胞中获得了该色素的异源生产。Kai等[13]通过编码引入3-羟基-3-甲基辅酶A还原酶、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸核酶和香叶基焦磷酸合成酶到丹参植物中，获得了高产量的二萜类化合物丹参酮，此类化合物广泛用于治疗心血管疾病。紫杉醇是有效的抗癌化合物，目前用于治疗卵巢癌、乳腺癌和肺癌，以及艾滋病卡波济氏肉瘤。紫杉醇在红豆杉树皮中含量极低，如今研究方向转为通过代谢工程提高紫杉醇产量，从而降低生产成本。通过前体喂养、杂交探针和差异基因表达研究证实了紫杉醇合成路径中19步假定的步骤[14-15]如图1所示。紫杉烯合成酶(TASY)是紫杉醇的生物合成最关键的一种酶，如果在毛状根培养时上调该基因的表达可以增加得到265%的紫杉醇产量[16]。Groteau等[17]通过正向调控参与脱落酸生物合成的关键基因-9-顺-环氧类双加氧酶基因，使红豆杉悬浮培养细胞的脱落酸积累量增加了48%和紫杉醇积累量达到2.7倍。

2.2 增加农作物产量和营养价值

2014年，粮农组织发布的《粮食不安全状况2014》指出，全世界饥饿人口高达10.2亿，创历史最高水平。利用代谢工程调控植物代谢可以增加农作物产量和营养价值，缓解粮食危机。2013年，Pons等[18]通过RNA干扰阻断内源性β胡萝卜素羟化酶基因(Csβ-CHX)增强了橙子中β-胡萝卜素的含量，同时通过过表达植物开花控制基因(CsFT)，缩短了果实成熟周期。在水稻胚乳中水仙花八氢番茄红素合成酶的表达使得无色胡萝卜素八氢番茄红素得以积累，获得“金谷”[19]。β-胡萝卜素羟化酶和β-胡萝卜素酮化酶是藻类中参与虾青素合成的两种关键酶，Huang等[20]将这两种酶在番茄中过表达增加了番茄中虾青素的含量，提高了番茄的营养价值。

图1 紫杉醇的生物合成途径Fig.1 Paclitaxel biosynthetic pathway

3 代谢工程在动物细胞的应用

动物细胞的生长代谢和生理模式比较复杂，另一方面体外细胞培养受外界影响因素比较大，代谢工程在动物细胞中发展起步要晚。

3.1 在生物制品生产中的应用

动物细胞培养优势在于其复杂的蛋白质表达能力，因此可以利用代谢工程优化代谢途径增加疫苗、抗体和生长因子等生物制品的生产，或者构建新的代谢途径生产特定的生物药物。杨振西等[21]通过构建乙肝病毒S-抗原和preS1抗原表位融合蛋白载体转入CHO细胞，筛选获得了高表达S蛋白的CHO细胞系。体外培养的动物细胞代谢往往由于产物积累使葡萄糖转化为乳酸的转化率升高，这会导致细胞生长缓慢，代谢副产物积累直至细胞死亡。重新改造细胞代谢途径方向，如在BHK-21细胞中导入丙酮羧酸化酶基因，不仅对细胞生长没有抑制作用而且能有效减少葡萄糖的消耗、降低乳酸产率[22]。

3.2 在医学研究中的应用

细胞程序化死亡是细胞受基因控制自主化凋亡的过程，代谢工程在动物细胞中的应用还体现在改变细胞凋亡程序、控制细胞循环周期。研究证明,在杂交瘤细胞中添加bcl-2等抑制细胞死亡的基因能显著提高细胞活力，延长生长期，导入IRF-1(干扰调节因子)的BHK细胞生长被阻滞[23]。另有一些基因如bax、bcl-xS、bad和bak能激活细胞内部线粒体凋亡程序从而促使细胞死亡[24]。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶类，是引起细胞凋亡的关键酶，在凋亡因子的作用下使细胞内部蛋白质降解发生凋亡[25]。控制细胞无限制生长和使癌变细胞凋亡可以在根本上治疗癌症和肿瘤，这些研究在癌症等疾病的基因治疗中给人们提供了思路。

4 问题与展望

代谢工程发展已有二十多年，大量物种的全基因组测定和功能基因组学技术出现，对物种的认识不仅限于代谢水平，而且能够从基因、RNA、蛋白质和代谢物等多层次分析物种，即后基因组时代的“系统代谢工程”。代谢工程通过重组DNA技术改造细胞特性，当前主要问题是如何正确诠释酶的功能特性来优化目标产物合成途径。尽管“组学”时代已经增加了许多可用的数据，但正确的诠释和酶的功能特性是代谢工程策略成功实施的关键。此外，生物合成途径之间复杂的相互作用和复杂的调控机制使得代谢工程进一步复杂。因此，更复杂的工程策略，其调节表达的多个通路基因或者调节器对于平衡产品是必须的。定义这些策略需要详细的系统知识和复杂的代谢模型，目前来说缺乏这些系统及代谢模型。当前稳定转换系统是耗费时间的，所以获得高转化产率显得格外重要。最后，对于实施这些代谢工程系统，适当的管理法规是很重要的，这可以使人们接受这些代谢工程产品。

代谢工程作为一种针对性比较强的生物代谢改造技术，其应用必将越来越广泛。随着资源匮乏、粮食危机和对药物需求量的增大，代谢工程在今后改善这些问题中将发挥重要作用。

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