核质转运障碍在肌萎缩侧索硬化-额颞痴呆发病机制中的研究进展

中国人民解放军总医院海南分院神经内科，海南 三亚 572013

肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和额颞痴呆（frontotemporal dementia，FTD）是2种渐进性且致命的神经退行性疾病，目前临床上尚无有效的治疗方法。ALS的特征性病理表现为上下运动神经元退变，临床表现为进行性肌肉萎缩、痉挛，构音不清，吞咽和呼吸困难。FTD是一种发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的原发性退行性痴呆，约占老年前期痴呆的20%[1]，其特征性病理表现为大脑额颞叶萎缩，临床表现为进行性人格和行为改变、认知障碍和记忆减退。部分ALS患者同时伴有FTD，临床表现为随意肌麻痹以及认知、执行和语言功能损害。越来越多的证据表明[2-3]，ALS和FTD的临床表现、病理特征和遗传特征有所重叠。统计数据显示，约15%的FTD患者合并ALS，22%～48%的ALS患者合并FTD[4]。ALS-FTD主要表现为2种临床症候群：一是ALS/运动神经元病（motor neuron disease，MND）症候群，主要表现为中老年起病的进行性肌无力和肌萎缩，尤以球部症状起病多见，下运动神经元损害症状大多较上运动神经元损害症状明显；二是FTD症候群，主要表现为精神行为异常、性格改变、非流利性失语、记忆障碍等。这2种临床症候群可同时出现或先后出现。FTD患者在合并ALS后，其平均生存期从8.2年缩短至2.4年[5]。

ALS-FTD的发病机制与基因、环境和老化等因素的相互作用有关。既往研究认为，ALS与FTD属于同一类蛋白病，其共同的发病机制主要为蛋白质的错误折叠。2006年以来的研究发现，反式激活应答DNA结合蛋白43（transactive response DNA binding protein 43 kDa，TDP-43）免疫反应阳性包涵体的形成是ALS和FTD的主要病理标志[6-8]。反式激活应答DNA结合蛋白（transactive response DNA binding protein，TARDBP）基因突变以及磷酸化、泛素化和N末端截短等修饰过程可引起病理性TDP-43蛋白。尽管仅在4%的家族性ALS患者和极少数FTD患者体内发现存在TARDBP基因突变，但在约97%的ALS患者和约45%的FTD患者体内发现TDP-43阳性包涵体[9-12]。由于TDP-43蛋白表达受核定位信号（nuclear localization signal，NLS）和转移信号等调控，并且容易受到机体生理状态的影响，因此在疾病和应激状态下，TDP-43蛋白可发生一系列病理学变化，受影响的神经元和胶质细胞内的TDP-43蛋白失去其正常的细胞核定位，而以包涵体的形式出现在细胞质中，从而引起神经元进行性变性，导致疾病的发生。一方面，病理性TDP-43蛋白发生了核质分布异常[13-14]，此异常可能会导致TDP-43蛋白毒性的获得和生理功能的丧失；另一方面，以TDP-43蛋白为代表的RNA结合蛋白还可以通过多种作用机制遏制正常的核质转运，这也是与ALS-FTD发病最为相关的致病基因——第9号染色体开放阅读框72（chromosome 9 open reading frame 72，C9ORF72）基因突变致病环节中的关键因素。那么，核质转运障碍是否为导致TDP-43蛋白核质分布异常的始动因素呢？本文旨在对核质转运障碍在ALS-FTD发病机制中的最新进展进行综述。

1 RNA结合蛋白是ALS-FTD疾病发生发展中的核心蛋白

2015年以来，陆续有研究报道了53种参与ALS或FTD包涵体形成的错误调节蛋白[15-19]，其中RNA结合蛋白占50%以上[20]。生物信息学分析结果显示，除TDP-43蛋白以外，其他RNA结合蛋白，如肉瘤融合（fused in sarcoma，FUS）蛋白、TATA结合蛋白相关因子2N、EWS RNA结合蛋白 1（EWS RNA-binding protein 1，EWSR1）、基质蛋白3、异质性胞核核糖核蛋白A1和A2B1等，均存在一个朊蛋白样结构域（prion-like domain，PrLD），而ALS-FTD的致病突变位点均发生在PrLD拉链结构中的关键保守序列[21-22]。该位点发生突变将阻碍RNA结合蛋白的正常核质穿梭平衡，使其在细胞质内积聚。FUS主要通过C3’末端的NLS介导核内输入。如果该位点发生突变，也可能阻碍转运蛋白介导的核内输入或直接影响其与运输因子的结合，导致FUS蛋白滞留在细胞质内[23]。除此之外，FUS蛋白的亚细胞定位还受甲基化水平的调控[24]。诱导甲基化可促进FUS蛋白在细胞质内富集，而抑制甲基化则可引起核内FUS蛋白的分布显著增加。

2 基因突变是导致RNA结合蛋白发生核质转运障碍的重要因素

C9ORF72基因是目前已知与ALS-FTD发病最为相关的致病基因[25-26]。流行病学研究发现，5%～7%的欧洲和北美洲散发性ALS或FTD患者的发病与C9ORF72基因相关；在家族性ALS或FTD中，与C9ORF72基因相关的发病所占比例更高，约40%的家族性ALS患者和20%的家族性FTD患者携带C9ORF72突变基因；C9ORF72突变基因的非编码区存在大量的GGGGCC六核苷酸重复扩增序列，其长度与ALS和FTD的严重程度和发病年龄相关[27]。这些非编码重复扩增序列通过转录产生重复RNA，这些非编码RNA继而通过富集大量的RNA结合蛋白，导致RNA结合蛋白介导的RNA正常代谢功能发生紊乱，包括特异性转录子的合成丢失和RNA剪接异常。

除了通过干扰细胞核和细胞质的代谢以发挥其毒性作用以外，含有突变序列的RNA在细胞核内形成RNA团簇（foci），后者通过非ATG依赖方式翻译得到5种二肽重复蛋白（dipeptide repeat protein，DPR）[28]，其中有2种含精氨酸的DPR经酵母模型和果蝇模型实验发现存在生物学毒性[29]。进一步的研究发现，一方面，含精氨酸的DPR通过模仿RNA结合蛋白的NLS，劫持细胞核输入，导致RNA结合蛋白在细胞质内集聚；另一方面，这些含精氨酸的DPR通过与RNA结合蛋白以及许多无膜细胞器组分之间相互作用，干扰正常的液－液相分离以及无膜细胞器的装配和解聚过程，诱导无膜细胞器失能，并聚集形成淀粉样纤维，从而诱发神经退行性疾病。在果蝇模型中，来源于C9ORF72突变基因过表达患者皮质神经元的GGGGCC重复序列，可导致果蝇复眼形态发生进行性的破坏，果蝇运动活力也明显降低；而RanGTP酶激活蛋白（Ran GTPaseactivating protein，RanGAP）过表达可抑制重复序列诱导的神经毒性，逆转果蝇复眼神经和运动神经的退行性变[30]。RanGAP在细胞质中可诱导RanGTP酶将GTP水解成GDP，从而确保高效的核质转运过程。因此，C9ORF72基因重复扩增序列突变不仅干扰了神经元内RanGAP的正常功能，还通过抑制核内输入过程，导致RanGAP蛋白错误定位以及在细胞质内异常聚集。

3 核孔失能和核质转运缺陷是ALS-FTD发病的关键

ALS-FTD是一种成年起病且呈慢性进展的神经退行性疾病，其核质转运体的转运效率和选择性随着年龄的增长而显著下降，在有丝分裂过程中发生周期性消失和重建的核膜，其核孔的渗透性修复功能也日益削弱[31]。尸检发现，ALS-FTD患者体内的多种核转运因子存在错误定位和异常聚集[32]。一方面，蛋白质稳态调节缺陷可能是重要的影响因素之一，细胞质内集聚的淀粉样蛋白及疾病相关蛋白如TDP-43蛋白片段可干扰核孔亚基及核转运因子的正常功能以及核质转运蛋白的溶解性，导致核输入转运缺陷[33]；另一方面，RNA代谢异常也是ALS-FTD病理机制中的重要环节。体外细胞系研究发现，条件性敲除TDP-43基因可导致多种细胞核转运因子的缺失或异常定位[34]。FTD小鼠模型研究发现，TDP-43蛋白发生异常的亚细胞定位可导致RanGTP酶缺失，且TDP-43蛋白功能缺失可导致Ran蛋白表达减少，而过表达Ran蛋白可逆转神经退行性变和小鼠皮质神经元TDP-43蛋白的错误定位。因此，笔者推测Ran蛋白可能成为潜在的逆转C9ORF72基因突变和TDP-43蛋白功能缺失所导致的神经退行性疾病的关键治疗靶点。

4 探索核质转运在ALS-FTD发病机制研究中的意义

ALS-FTD并非单基因疾病，目前有关核转运蛋白的遗传学研究较少。一项动物模型实验发现Gle1 RNA核输出介导因子在ALS-FTD发病中具有重要作用，敲除Gle1基因可诱导胚胎斑马鱼出现运动神经元发育缺陷，而过表达野生型Gle1基因则可逆转此过程[35]。

目前有关ALS-FTD究竟是脑疾病还是周围神经病变，仍存在较多争议。2017年发表的一项研究支持ALS-FTD属于原发性新皮质疾病，并在散发性ALS患者体内发现了TDP-43蛋白包涵体的特定扩散径路；随着病程的进展，新皮质神经元内含有的毒性TDP-43蛋白通过轴突、突触或直接接触进行扩散，顺向传递至脑干和脊髓前角细胞，并从可溶性转变为不可溶性，继而引起下游神经元内正常核蛋白功能缺失[36]。然而，目前尚未明确新皮质内抑制细胞质内TDP-43包涵体集聚的机制。

5 小 结

自从发现TDP-43蛋白是ALS和FTD包涵体的主要组分后，人们对于这种RNA结合蛋白的了解日益深入。一系列研究已揭示TDP-43蛋白存在异常的细胞质定位。生理状态下，TDP-43蛋白在细胞质内合成，继而转变为稳定的多肽；大部分的成熟TDP-43蛋白被转运至细胞核内，通过与反式激活应答DNA结合，发挥调节转录的作用，并参与mRNA的修饰。由此推测，核膜转运缺陷即TDP-43蛋白核内转入缺陷导致的TDP-43蛋白正常功能丢失及获得性神经毒性可能是ALSFTD发病的始动因素之一。尽管如此，这些病理性TDP-43蛋白的产生及获得性神经毒性的机制，仍有待进一步研究。

本课题组的前期工作主要是致力于探索和发现与ALS病变关键特征相关的潜在生物学标志物，通过结合神经病理变化予以验证。今后，需要进一步探索并阐明ALS-FTD发病中TDP-43蛋白免疫反应阳性包涵体形成的具体过程及其机制。

致谢

衷心感谢中国人民解放军总医院神经内科沈定国教授（兼中华医学会神经病学分会神经肌肉病学组组长）在本文写作过程中给予作者的指导。