不同提取方法对灵芝孢子油的影响

杨文婧，周 俊，庞 敏，操丽丽

灵芝是一种药用真菌，其含有丰富的生理活性物质，包括三萜类、灵芝多糖、甾醇等。灵芝孢子是灵芝的有性生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质。灵芝孢子油是灵芝孢子的脂质提取物，富含三萜类灵芝酸、多不饱和脂肪酸[1-2]，具有抗肿瘤[3-4]、免疫调节[5]、保护调节神经系统[6]、降血脂[7]、保肝护肝[8-9]等生理活性。因此，对灵芝孢子油的研究是灵芝研究的一个热点。

目前，灵芝孢子油的提取主要是采取溶剂浸提法、超临界CO2萃取法[10]等。超临界CO2萃取法具有无化学溶剂消耗和残留、无污染、工艺简单、萃取物纯度高等优点，但由于其设备昂贵、生产成本高、批处理量小等缺点，其在工业化上的应用也受到了一定的限制[11-12]。溶剂浸提法具有生产成本小、提取率较高、操作简单等优点，但存在溶剂残留的问题。水酶法具有工艺条件温和安全、操作温度低、能耗低、能有效地保护油脂的品质等优点，已应用于大豆油、花生油、玉米胚芽油等油脂工业中，但关于用水酶法提取灵芝孢子油鲜见报道[13-14]。试验采用超临界CO2萃取法、索氏抽提法、水酶法3种方法对灵芝孢子油进行提取，以灵芝孢子油的提取率为指标，对3种提取方法进行比较分析，确定灵芝孢子油的最佳提取方法，旨在为今后灵芝孢子油的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

破壁灵芝孢子粉（破壁率≥99.9%），安徽黄山云乐灵芝有限公司提供。

齐墩果酸标准品（纯度≥98%，色谱级）、中性蛋白酶（80 000 U/g），北京索莱宝科技有限公司提供；石油醚（沸程30～60℃）、无水乙醇、乙酸乙酯、香草醛、冰醋酸、无水硫酸钠等试剂均为分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司提供；正庚烷、甲醇，色谱纯，美国Merck公司提供。

食品级CO2，纯度大于99.5%。

1.2 仪器与设备

TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；HA121-50-01-C型超临界CO2萃取装置，江苏南通华安超临界萃取有限公司产品；AL104型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；SER158/3型全自动索氏提取仪，意大利VELP公司产品；7890A型气相色谱仪，安捷伦科技有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 索氏提取法提取灵芝孢子油

在50℃烘箱中烘干破壁孢子粉至恒质量，准确称取5.0 g破壁灵芝孢子粉于滤纸筒中；在已经干燥至恒质量的抽提瓶中倒入约2/3，使其能浸没滤纸筒，在萃取温度60℃条件下，考查萃取时间分别为4，5，6，7 h对灵芝孢子油得率的影响；得到石油醚萃取液、减压蒸馏后，收集油样待测。

1.3.2 水酶法提取灵芝孢子油

在50℃烘箱中烘干破壁孢子粉至恒质量，称取10.0 g破壁灵芝孢子粉，按1∶5（g∶mL） 的料液比加入0.025 mol/L的磷酸缓冲液（pH值6.8），使其浸泡1 h后，在100℃水浴锅高温灭酶10 min，取出待物料，降到酶解所需温度50℃时，按2 000 U/g加入中性蛋白酶，分别研究酶解2，3，4，5 h对灵芝孢子油得率的影响。将酶解液以转速5 000 r/min离心10 min后，收集上层清油并用无水Na2SO4干燥后保存用于待测[8-11]。

1.3.3 超临界CO2萃取法提取灵芝孢子油

在50℃烘箱中烘干破壁孢子粉至恒质量，称取50 g破壁灵芝孢子粉置于500 mL萃取釜中，CO2流量20 L/h，在预试验的基础上，对影响超临界萃取效果的萃取温度、萃取压力、萃取时间等因素采用L9（34）正交试验设计，以灵芝孢子油得率为指标，进行萃取工艺条件优化，所得萃取液经减压蒸馏后，收集油样待测。

超临界CO2萃取工艺因素与水平设计见表1。

表1 超临界CO2萃取工艺因素与水平设计

1.3.4 孢子油得率的计算

1.3.5 三萜类物质含量的测定

（1） 标准曲线的绘制。精密称取 10 mg齐墩果酸，以无水乙醇为溶剂，配制成50 mL质量浓度为0.2 g/L的齐墩果酸乙醇溶液。精密吸取齐墩果酸标准液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL分别置于10 mL具塞试管中，加热挥去溶剂，再加入0.4 mL新制的5%香草醛-冰醋酸液及1.6 mL高氯酸，在70℃恒温水浴加热15 min，冷却至室温后再加入4 mL乙酸乙酯稀释，于波长560 nm处测定吸光度[15-16]。以吸光度为纵坐标，齐墩果酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为Y=4.195 7X+0.155 2，该方程的相关系数为0.999。

（2）孢子油中三萜类物质含量的测定。准确称取一定量灵芝孢子油样品充分溶解于乙酸乙酯中，取1.0 mL溶液于水浴上蒸干溶剂后，按上述同样方法处理后测定吸光度，计算三萜类物质的含量。

1.3.6 灵芝孢子油脂肪酸组成的测定

（1） 脂肪酸的甲酯化。取20 mg孢子油于圆底烧瓶中，加入2 mL 0.5 mol/L甲醇钠溶液，加热回流20 min后，再加入2 mL 0.5 mol/L的硫酸甲醇溶液，煮沸10 min。取出烧瓶，冷却后，用2 mL正庚烷萃取2次，合并萃取液，用无水Na2SO4干燥2次，过滤备用进行GC分析[17-18]。

（2） 灵芝孢子油脂肪酸组成分析。GC条件为DB-WAX型毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；程序升温：100℃保持1 min，以20℃/min升温至200℃，再以3℃/min升温至230℃，保持12 min；进样口温度230℃，FID温度250℃，分流比1∶50，进样量1μL；载气：N2，载气流速0.8 mL/min。

脂肪酸组成采用面积归一法进行计算。

2 结果与分析

2.1 灵芝孢子油的提取

2.1.1 索氏抽提法

不同提取时间对孢子油提取率的影响见表2。

由表2可知，随着提取时间的增加，提取率先呈增加的趋势，当提取时间达到6 h以后，提取率基本不再增加，随着孢子油提取率增加，孢子油中三萜化合物的含量也在不断增加。这可能是由于随着提取时间的增加，有机溶剂与灵芝孢子接触越充分，抽提效果也就越充分，当提取时间达到6 h以后，灵芝孢子中脂类物质基本上都被抽提出来，孢子油提取率基本不再增加了。

表2 不同提取时间对孢子油提取率的影响

2.1.2 水酶法

不同酶解时间对提取效果的影响见表3。

表3 不同酶解时间对提取效果的影响

由表3可知，随着酶解时间的增加，提取率没有太大的变化，提取率都较低，这可能是由于水酶法中油与蛋白质、多糖等形成了稳定的乳化液，严重影响了提油率。但提取的孢子油中的三萜化合物的含量在不断提高，酶解5 h时提取的孢子油中三萜化合物含量达到28.96%，这可能是由于三萜化合物结构中存在亲水的羟基基团，相较于灵芝孢子油易于溶入乳化液中。

2.1.3 超临界CO2萃取法

正交试验结果与分析见表4。

表4 正交试验结果与分析

从表4中极差分析结果可以看出，3个因素对灵芝孢子油提取率的影响大小依次为萃取压力（B）＞萃取时间（C） ＞萃取温度（A）。在试验设计范围内，优化得到超临界CO2萃取灵芝孢子油的最佳条件为A2B2C2，即萃取压力30 MPa，萃取温度45℃，萃取时间3 h，CO2流量20 L/h，该组合没有在正交试验的9个组合中出现，验证试验结果表明，在此条件下灵芝孢子油的提取率为24.63%，孢子油中三萜化合物的含量为25.15%。

2.2 孢子油中脂肪酸组成分析

灵芝孢子油的脂肪酸GC图谱见图1，灵芝孢子油主要脂肪酸组成见表5。

图1 灵芝孢子油的脂肪酸GC图谱

表5 灵芝孢子油主要脂肪酸组成

由图1和表5可知，3种提取方法得到的灵芝孢子油中脂肪酸种类没有差异，主要由软脂酸、软脂油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等脂肪酸组成，并且各种脂肪酸含量也不存在显著差异。灵芝孢子油中不饱和脂肪酸含量高，可达80%以上，其中油酸的含量超过60%，并富含亚油酸，使灵芝孢子油具有降低血脂、降血压、软化血管等生理活性。

3 结论

比较了索氏抽提法、水酶法、超临界CO2萃取法对灵芝孢子油提取效果的影响，结果表明水酶法的提取率最低，但其孢子油中含有的三萜类物质含量最高。索氏提取法提油率最高，三萜类物质含量却是最低的，3种提取方法提取的孢子油脂肪酸组成和含量没有显著影响，且灵芝孢子油中富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸。通过正交试验优化得到超临界CO2萃取灵芝孢子油的最佳条件为萃取压力30 MPa，萃取温度45℃，萃取时间3 h，CO2流量20 L/h，在此条件下灵芝孢子油的得率为24.63%，其中三萜类化合物的含量为25.12%。

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