miR21对宫颈癌Hela细胞及顺铂耐药Hela/DDP细胞顺铂敏感性的影响

岳晓雪+苗劲蔚+路攀

[摘要] 目的 探討miR21基因表达水平对宫颈癌Hela细胞及其顺铂耐药Hela/DDP细胞顺铂敏感性的影响。 方法 利用riboFECTTM CP转染试剂分别将成熟miR21 mimic、inhibitor及其阴性对照试剂NC转染至Hela与Hela/DDP细胞，并将Hela细胞分为mimic组、阴性对照（NC）组和空白对照（Blank）组，将Hela/DDP细胞分为inhibitor组、阴性对照NC组和空白对照（Blank）组。Real-time PCR检测各组细胞中miR21的表达水平；MTT检测各组细胞对顺铂的半数抑制率浓度（IC50值）。 结果 ①Real-time PCR检测miR21在Hela/DDP中高表达，是Hela的（5.452±0.074）倍（P < 0.01）；转染mimic后，Hela中miR21表达高于明显NC组及Blank组（P < 0.01），NC组与Blank组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）；转染inhibitor后，Hela/DDP中miR21表达明显低于NC组及Blank组（P < 0.01），NC组与Blank组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。②MTT结果显示，转染mimic后Hela细胞对顺铂敏感性下降，与NC组及Blank组相比，差异有统计学意义（P < 0.05），NC组与Blank组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）；转染inhibitor后Hela/DDP细胞对顺铂敏感性增加，与NC组及Blank组相比，差异有统计学意义（P < 0.05），NC组与Blank组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 ①miR21在Hela/DDP中高表达，在Hela中低表达。②上调miR21在Hela中的表达能明显降低其对顺铂的敏感性，下调miR21在Hela/DDP中的表达能明显增加其对顺铂的敏感性。

[关键词] 宫颈癌细胞；顺铂耐药细胞；miR21；顺铂；化疗敏感性

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（c）-0025-04

[Abstract] Objective To detect the influence of miR21 gene expression on the sensitivity of cervical cancer Hela cells and cisplatin-resistant Hela/DDP cells to cisplatin. Methods Mature miR21 mimic， inhibitor and negative control （NC） miRNA were transfected into Hela and Hela/DDP cells by riboFECTTM CP. Hela cells were divided into mimic group， NC group and Blank group and Hela/DDP were divided into inhibitor group， NC group and Blank group. Real-time PCR was used to measure the expression of miR21 in each group. MTT was used to detect the half inhibitory concentration （IC50） of cisplatin. Results ①Real-time PCR results showed that the expression of miR21 was an average of （5.452±0.074） fold higher in Hela/DDP than in Hela （P < 0.01）. The expression of miR21 in mimic group was obviously higher than those in NC and Blank groups （P < 0.01）. The expression of miR21 in inhibitor group was significantly lower than those in NC and Blank groups （P < 0.01）. There was no statistical difference between NC group and Blank group in Hela and Hela/DDP cells （P > 0.05）. ②MTT results showed that the sensitivity of Hela to cisplat in decreased after mimic transfection while the Hela/DDP increased after transfected with inhibitor （P < 0.05）. There was no significant difference between NC group and Blank group （P > 0.05）. Conclusion ①The expression of miR21 is upregulated in Hela/DDP cells， while it wis down regulated in Hela cells. ②Over expression of miR21 in Hela can reduce its sensitivity to cisplatin obviously. Inhibition of miR21 in Hela/DDP can significantly increase its sensitivity tocisplatin.endprint

[Key words] Hela； Hela/DDP； miR21； Cisplatin； Cheo？鄄sensitivity

宫颈癌是女性生殖系统发病率最高的恶性肿瘤[1]。目前治疗方案主要为手术辅助铂类药物化疗及同步放化疗。同步放化疗相比单纯放疗可明显提高中晚期宫颈癌患者的生存率，延长生存时间[2]。铂类抗癌药物作为术前或术后的辅助治疗，在一定程度上改善了患者预后，在宫颈癌的治疗中占有重要位置。有研究结果提示，某些基因的表达水平可能与肿瘤细胞对顺铂的敏感性相关[3-4]。microRNAs是一类单链非编码小RNA，可通过调控不同靶点在肿瘤细胞对化疗药物敏感性方面发挥重要作用[5-6]。研究表明miR21与多种肿瘤耐药相关[7-10]，但其表达水平与宫颈癌化疗耐药的关系仍不清楚。因此，本研究对细胞进行瞬时转染外源性改变miR21的表达水平，进而探索其对Hela及Hela/DDP顺铂敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌顺铂耐药细胞株Hela/DDP购自北那生物BNCC细胞库，人宫颈癌亲本细胞株Hela由军事科学院军事医学研究院生命组学研究所惠赠，顺铂（10 mg/支）购自山东齐鲁制药有限公司（批号：H37 021358）。DMEM、胎牛血清FBS购自Gibco公司，胰蛋白酶购自南京凯基生物科技有限公司，MTT、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司，miRNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量检测试剂盒购自天根生化科技有限公司；miR21 mimic、inhibitor、negative control及riboFECTTM CP购自锐博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Hela、Hela/DDP细胞培养于含有10%FBS的DMEM培养基中（5%CO2、37℃），胰酶常规消化、传代。

1.2.2 细胞转染 采用riboFECTTM CP分别转染mimic、inhibitor和NC。mimic组转染50 nmol mimic，inhibitor组转染100 nmol inhibitor，阴性对照（NC）组分别转染mimic NC、inhibitor NC，空白对照（Blank）组不做转染，转染后培养箱继续培养。

1.2.3 Real-time PCR检测miR21表达 收集转染48 h后的细胞，采用miRNA提取试剂盒提取总miRNA，加尾反转录试剂盒将miRNA反转录为cDNA，然后进行PCR扩增。反应体系（20 μL）：（2X）miRcute Plus miRNA Premix 10 μL，上下游引物各0.4 μL（下游引物为试剂盒配备），（50X）ROX Reference Dye 2 μL；cDNA模板各2 μL，ddH2O 5.2 μL。U6为内参。miR21上游引物序列为5′-CCCTCACAGACTGATGTTGAAA-3′。U6基因上游引物序列为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。PCR反应条件：95℃ 15 min变性；94℃20 s，64℃ 30 s，72℃，34 s（5个循环）富集目标miRNA；94℃，20 s，60℃，34 s（45个循环）退火延伸。反应均设三个复孔。Ct值（2-ΔΔCt）公式对数据进行相对定量分析。ΔΔCt=（CtmiR21-CtU6）转染组-（CtmiR21-CtU6）对照组。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖活性 细胞转染后继续培养24 h，制备成单细胞悬液，5×103个/孔接种于96孔板中，100 μL/孔，设加药组、调零组和空白对照组，每个浓度设3个复孔。贴壁后弃上清，分别在Hela和Hela/DDP细胞中加入180 μL培养基，20 μL终浓度为（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160）μg/mL的顺铂，继续培养48 h后每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），37℃避光孵育4 h，弃上清，加DMSO 150 μL/孔，充分振荡使结晶溶解。酶标仪测定490 nm波长处的吸光度值，3个复孔取平均值。实验重复3次，应用统计软件绘制细胞存活率曲线并求出IC50值。

1.3 统计学方法

采用Graphad Prism 5.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hela/DDP与Hela对顺铂的敏感性

不同浓度顺铂作用48 h后，Hela/DDP及Hela对顺铂的IC50分别为（35.480±0.155）μg/mL、（5.260±0.206）μg/mL，前者是后者的（6.754±0.235）倍，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 Hela与Hela/DDP细胞miR21的表达

Real-time PCR法检测Hela/DDP与Hela细胞中miR21的表达，结果显示miR21在Hela/DDP与Hela中表达量分别为（5.450±0.081）、（1.000±0.002），前者是后者的（5.452±0.074）倍，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2。

2.3 转染mimic或inhibitor后miR21表达变化

2.3.1 Hela细胞miR21表达变化 转染50 nm mimic后，結果显示mimic组高表达，表达量为（7.611±0.025），与NC组（1.089±0.021）及Blank组（1.000±0.002）相比，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；NC组与Blank组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3A。endprint

2.3.2 Hela/DDP細胞miR21表达变化 转染100 nm inhibitor后miR21的表达，结果显示inhibitor组低表达，表达量为（1.181±0.030），与NC组（4.943±0.057）及Blank组（5.450±0.081）相比，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；NC组与Blank组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3B。

2.4 转染mimic或inhibitor后细胞增殖的变化

2.4.1 Hela转染mimic后细胞增殖的变化 给予不同浓度的顺铂，MTT检测结果显示mimic组IC50为（9.027±0.065）μg/mL，与NC组[（5.176±0.044）μg/mL]及Blank组[（5.083±0.030）μg/mL]相比，差异有统计学意义（P < 0.05）；NC组与Blank组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4A。

2.4.2 Hela/DDP转染inhibitor后细胞增殖的变化 给予不同浓度的顺铂，MTT检测结果显示，inhibitor组IC50为[（2.517±0.080）μg/mL]，与NC组[（31.205±0.192）μg/mL]及Blank组[（31.255±0.140）μg/mL]相比，差异有统计学意义（P < 0.05）；NC组与Blank组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4B。

3 讨论

miR21在实体瘤和非实体瘤中均呈现高表达[11-15]，如肺癌、胰腺癌、骨肉瘤、宫颈癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤等，也是肿瘤患者血清中第一个被检测到的微小RNA[16]，在人类miRNA功能学研究中占有重要地位。Wang等[17]研究结果提示，miR21基因表达量在乳腺癌耐阿霉素细胞中较高，干扰miR21在亲本细胞中的表达可改变其对阿霉素的耐药性。在恶性胶质瘤细胞中，下调miR21的表达可增加恶性胶质瘤细胞对替尼泊苷敏感性[18]。改变卵巢癌及肺癌中miR21的表达也会产生类似的效果[19-20]。这些研究提示肿瘤细胞化疗耐药与miR21表达水平有关，然而关于miR21具体在宫颈癌化疗耐药方面的报道目前较少。

本实验通过Real-time PCR法研究miR21表达水平在Hela及Hela/DDP细胞中对顺铂敏感性的影响。结果提示，miR21在Hela/DDP中的表达水平高于Hela（P < 0.05）。将mimic、inhibitor及其阴性对照转入Hela与Hela/DDP细胞，结果提示，上调miR21在Hela细胞中的表达能明显降低其对顺铂的敏感性，下调miR21在Hela/DDP细胞中的表达能明显增加其对顺铂的敏感性。但是miR21是通过何种机制调控细胞化疗敏感性仍不清楚。

miRNA裂解靶基因或抑制翻译是通过与靶基因结合，因此推测miRNA功能的一个最直接手段是寻找下游靶基因。荧光素酶报告基因检测系统发现miR21可与PTEN基因的3′UTR结合，进而抑制靶基因表达即PTEN mRNA是miR21的一个直接作用靶点[17]，这为进一步研究miR21在宫颈癌耐药中的分子机制提供依据。

此外，本研究结果提示，miR21在Hela/DDP中表达量明显高于Hela，且上调miR21的表达会降低Hela对顺铂的敏感性，下调miR21的表达会增加Hela/DDP对顺铂的敏感性。这为提高宫颈癌化疗敏感性提供了新的靶点，为临床上攻克宫颈癌化疗不敏感难题提供了新思路。PTEN为miR21的直接靶点，故推测miR21可能通过调节PTEN影响宫颈癌细胞顺铂耐药性，尚需进一步研究证实。

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（收稿日期：2017-09-21 本文編辑：李岳泽）endprint