GB/T 18204.4-2013《公共场所卫生检验方法 第4部分：公共用品用具微生物》存在问题的探讨

段朝标　肖利军　李慧

县级以上疾病预防控制机构应当承担卫生计生行政部门下达的公共场所健康危害因素监测任务[1]。公共场所卫生监测是省市县三级疾控机构在健康危害因素监测与干预基本职责中的主要工作任务。随着人们生活水平不断提高，消费观念的转变，公共场所卫生质量越来越受到重视。公共场所卫生监测已成为各级疾控机构重要的日常工作。

国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会于2013年12月31日发布GB/T 18204.4-2013《公共场所卫生检验方法 第4部分：公共用品用具微生物》[2]（以下称2013年版标准），并于2014年12月1日正式实施。2013年版标准代替了GB/T 18204.2～18204.8-2000、GB/T 18204.11～18204.12-2000等9个公共场所公共用品用具微生物卫生检验方法的全部内容，部分代替GB/T 17220-1998《公共场所卫生监测技术规范》中的公共用品用具采样要求[3]，集中用一个标准规定了公共场所用品用具的检验方法；将原2000年版的单个检验方法中的采样方法归集至新标准的规范性附录A中，并对用品用具种类进行了新的分类和命名。但在实际使用中发现2013年版标准中仍然存在较多问题。本文通过对照与GB/T 18204.4-2013同期有关细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、真菌总数和溶血性链球菌5种微生物检验相类似的国家标准检验方法，并结合笔者在实际检验过程中的经验，对该标准中在术语描述、技术细节及编排等方面存在的不足之处，提出了更改建议，以期为今后此标准的再次修订提供有益参考，促进公共场所卫生检验方法不断完善。

本文依照2013年版标准编排格式的顺序进行论述，对相应条款存在的问题予以指出和探讨。

1　标准的范围部分

2013年版标准第一段描述“本部分规定了公共场所用品用具细菌总数……的采样和测定方法”。这里使用的术语“测定”不够准确。测定是指获得某一特定对象的数据信息的方法和过程。而本部分方法中大肠菌群、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌均为定性实验，所以统一使用“检验”更确切。包括第二段的“……的测定”也应改为“检验”。另外本节第二段金黄色葡萄球菌错印为“金黄葡萄球菌”。

2　细菌总数平皿计数法部分

2.1　培养基和试剂

生理盐水（原标准3.1.1）的描述存在三个不妥之处：（1）称谓：“生理盐水”应该称为“无菌生理盐水”；（2）“生理盐水成分”的“成分”应另起一行，与“制法”条款对应，即为“3.1.1生理盐水，3.1.1.1 成分，3.1.1.2 制法”的编排结构；（3）无菌生理盐水不宜以10 mL每管分装后灭菌。为防止高压灭菌时导致试管中液体流失而引起体积不准确，一般应将灭菌后的生理盐水按试验实际需要（9 mL或10 mL或20 mL等）无菌操作分装到灭菌试管中备用。

营养琼脂成分（原标准3.1.2）编排中出现了3.1.1同样的不妥之处。另外本条还出现错误：作为细菌总数培养中的唯一培养基“营养琼脂”在3.3.4 样品的培养中却以“平板计数琼脂培养基”出现，营养琼脂培养基与平板计数琼脂培养基的成分不同，并非同一培养基。目前实验室已经普遍使用商品化的“平板计数琼脂”替代“营养琼脂”用于菌落总数计数试验。平板计数琼脂代替营养琼脂，培养基成分的改变更利于细菌的恢复和生长[4]。

2.2　仪器和设备

“3.2.8 无菌试管、平皿（直径9 cm）、刻度吸管等”有3处需改进的地方：（1）所用器具应标明规格和精度，无菌试管在本处的规格应该为15 mm×140 mm，刻度吸管的规格为1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）；（2）为使描述更为严谨：平皿及刻度吸管均应无菌，应该描述为“无菌平皿、无菌吸管”；（3）在刻度吸管后应加上“或微量移液器及吸头”，本处未对移液器及吸头进行描述，但在3.3 检验步骤中却多次提及。

2.3　不同稀释度菌落计数计算规则（原标准3.5）

在3.5.1中，“……乘以相应的稀释倍数，作为每毫升中菌落总数结果”存在语法错误，每毫升是一个数量，缺少主语，应当描述为“每毫升试样中菌落总数结果”；即使这样也还存在问题：公共用品用具检测采集的样品是器具表面的“一定面积”，即用无菌棉拭子涂抹一定面积，将采样棉拭子浸入10 mL无菌生理盐水制成“检验初始液”，也即以10 mL生理盐水代替“一定面积”进行实验室检验，因此菌落总数计算结果可以认为是10 mL检验初始液所含菌落总数，这样便于在3.6结果报告中计算公共用品用具的菌落总数。在3.5.2、3.5.5中存在类似问题：3.5.2中N.一定面积的菌落总数，也即10 mL检验初始液所含菌落总数，其单位应为CFU，而非CFU/mL；3.5.5中“若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，以小于1乘以最低稀释倍数计算”，本标准中采集的样品并不存在液体原液样品。

另外，本节中的10 mL检验初始液所含的菌落总数应当指明以“N”指代，而不是只表示3.5.2中所计算的结果。这也是对3.6结果报告的衔接。在3.5.2中“N”值的计算公式采用美国食品药品管理局（FDA）《细菌学分析手册》第3章菌落总数（2001年 ）（Bacteriological Analytical Manual，Chapter 3;Aerobic plate count，2001）[5]，首次使用于 GB/T 4789.2-2008《食品微生物学检验菌落总数测定》，并经GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》修改了菌落总数计算公式中的解释[6]，此后，在制定其他种类样品的菌落总数检验标准时，这个菌落总数计算方法一直被引用。但2013年版标准在引用时只是照搬引用，而未根据公共场所样品采集的特殊性进行必要的修改。

2.4　结果报告（原标准3.6）

本节中存在计算公式错误和缺少关键性描述。

计算公式：A= N×b/k及其对相应字母的注释中存在以下错误：（1）A-细菌总数测定结果。没有给出单位，不能体现相应样品的结果；（2）N-平板平均菌落数，单位为CFU；平板平均菌落数，太过笼统，与3.5相关内容脱节；（3）b-稀释倍数，此处出现稀释倍数，与3.5相关内容脱节；（4）k-根据采样面积、标准限值单位得出的系数。k值不是一种系数，而是指代一定的采样面积，即依照本标准规范性附录A采集不同类型样品时的面积，即使是系数，也应当在此处表述清楚每种样品所代表的系数的数值和意义。

根据3.5计算规则得出10 mL检验初始液的菌落总数值（N），公共用品用具菌落总数可以使用公式计算：A=N/S，其中A-公共用品用具细菌总数结果，单位为CFU/S cm2；N为3.5所得10 mL检验初始液的菌落总数；S为10 mL检验初始液指代的公共用品用具采样面积的数值，具体数值见本标准附录A《公共场所公共用品用具微生物采样方法》。这个计算公式保持了与本标准总体相关内容的衔接，计算过程明确，指向清楚，不会产生歧义。

本节缺少菌落总数报告时的关键性描述：数值修约、结果判定、空白对照说明等。因此将结果计算列为3.6.1，则还需补充3.6.2 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告；3.6.3菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后；取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字；3.6.4 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。3.6.5 若空白对照上有菌落生长，则此次检验结果无效。

3　大肠菌群多管发酵法部分

3.1　检验步骤

原标准4.3.2中“检样倒入双料乳糖胆盐发酵培养液中”未指明检样的来由和使用体积。检样应当指明为“将放有采样后棉拭子的试管充分震摇，此液为1∶10的检验初始液（检液）”；应当指明将多少毫升检样“接种”到双料乳糖胆盐发酵管中；使用“倒入”一词显得不专业，“双料乳糖胆盐发酵培养液中”应当描述为“10 mL带小倒管的双料乳糖胆盐发酵管中”。本条第三句，未将产酸、产气的观察现象具体描述，应描述为“观察产酸（培养液变黄），产气（小倒管中有气体）现象”。

证实性试验（原标准4.3.4）：应该将“挑取可疑大肠菌群菌落1个～2个进行染色镜检”描述为“挑取可疑大肠菌群菌落不少于3个（不足3个全挑）进行染色镜检”。另外，本条描述不完整，证实性试验培养后缺少观察的现象和结果。应将4.4中“凡乳糖发酵管最终产酸、产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌”在4.3.4中作为观察现象描述，并表明结果“则为大肠杆菌阳性”。

3.2　结果报告

标准原文只描述了“检出大肠菌群”的结果，无“未检出大肠菌群”结果。结合4.3 检验步骤中相关调整，结果报告应描述为“综合以上实验结果，报告检出或未检出大肠菌群”。

在“4 大肠菌群多管发酵法”的操作中未使用多管（2管以上）双料乳糖胆盐发酵管进行试验，与方法命名不符。根据GB 9663-1996公共用具清洗消毒卫生标准规定大肠菌群使用的单位为“个/50 cm2”[6]，而使用多管发酵法的报告结果为大肠菌群最可能数（MPN），如要报告为“个/50 cm2”，宜采用大肠菌群平皿计数法检验更为合理。

4　真菌总数平皿计数法部分

4.1　检验步骤

该部分内容只有样品稀释过程，缺少“样品的接种”关键性步骤详细描述，6.3.2中第二段话不能表明样品接种的内容；缺少空白对照接种的描述。

4.2　菌落计数

此部分存在的错误与细菌总数平皿计数法中3.4、3.5、3.6相同，在此不再赘述。

5　溶血性链球菌培养法部分

5.1　培养基和试剂

葡萄糖肉浸液肉汤成分（原标准7.1.1）中缺少关键的葡萄糖成分，按1%的含量算，主成分葡萄糖应该是10 g。主要试剂中还缺少溶血性链球菌的生化鉴定试剂。7.1.6 灭菌生理盐水未指明其成分和制法的来源：见细菌总数平皿计数法中培养基和试剂3.1.1。

5.2　操作步骤

操作步骤（原标准7.3.2）中缺少关键的细菌鉴定试验：触酶试验和链激酶试验。特别是在7.1培养基和试剂中列出了链激酶试验所用试剂草酸钾人血浆和0.25%氯化钙，却并没有针对性的进行鉴定试验描述。

6　规范性附录A

在A.3采集部位与采集面积中，A.3.1杯具采样总面积为50 cm2，而GB 9663-1996《旅店业卫生标准》中茶具细菌总数的单位为cfu/mL[7]，没有任何依据证明将采样面积与茶具盛装液体进行相互换算的科学性和必要性。

原标准A.3.2、A.3.3、A.3.7中规定，“每25 cm2采样面积为1份样品，每件样品共采集2份样品”，但未指明两份样品的用途，按每份样品都要出具检验结果，则同一件样品可能会出现两个不同结果，没有明确说明如何处理这两个结果，致使该标准的使用者无法进行结果判定。

7　讨论

本标准修订时合并了2000年版9个公共场所用品用具微生物卫生检验方法，从目前修订的效果来看，整个修订并未对整合以前版本的整体相关性进行严谨的论证，缺乏与以前版本的延续性，并未对以前版本存在的部分缺陷进行修正。希望后续版本能够改进，保证标准修订后更具严谨性、延续性、整体性。

1996年发布实施的公共场所卫生标准（GB 9663- GB 9673，GB 16153）整体已经明显落后于社会发展，无法适应经过二十多年来公共场所事业快速发展的现实卫生状况，公共场所卫生标准一直没有修订也迟滞了公共场所卫生检验标准方法进行实质修订[8]。2013、2014年版的公共场所卫生检验方法进行了大幅度的修改，取得了较好的效果，但公共场所卫生标准不进行更新，就无法从根本上突破公共卫生检测检验工作的发展瓶颈，因此相关部门应加大力度推出新的卫生标准。

[1]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会． 公共场所卫生管理条例实施细则（卫生部令第80号）[EB/OL]． [2017-10-16]．http：//www．nhfpc．gov．cn/zwgk/wlwl/201103/92f44402042549258 9f273a486468903．shtml．

[2]国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员． 中华人民共和国国家标准批准发布公告2013年第27号[S/OL]． [2017-10-16]． http：//www．csres．com/notice/42412．html．

[3]国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会． GB/T 18204．4-2013公共场所卫生检验方法 第4部分：公共用品用具微生物[S]． 北京：中国标准出版社，2014：Ⅲ．

[4]杨庆文，国译丹，周惠新，等． 不同浓度TTC平板计数琼脂细菌生长试验观察[J]． 中国卫生检验杂志，2012，22（1）：62-63．

[5]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会． GB/T 4789．2-2008食品微生物学检验菌落总数测定[S]． 北京：中国标准出版社，2009：3-4．

[6]中华人民共和国国家卫生部． GB 4789．2-2010国家食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[S]． 北京：中国标准出版社，2010：1-4．

[7]国家技术监督局． GB 9663-1996 旅店业卫生标准[S]． 北京：中国标准出版社，2006：2．

[8]郝欣欣，阮水富． 公共场所卫生监督现状及法律修订对策研究[J]．中国卫生法制，2017，25（6）：45-47．