GB/T 18204.3-2013《公共场所卫生检验方法 第3部分：空气微生物》中有关嗜肺军团菌检验存在的问题及修订建议

郑盈翔

国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会于2013年12月31日发布2013年第27号公告，批准了《公共场所卫生检验方法 第1部分：物理因素》等5项标准，这些标准已于2014年12月01日起正式实施。其中GB/T 18204.3-2013《公共场所卫生检验方法 第3部分：空气微生物》[1]（以下简称“本标准”）与上一个版本GB/T 18204.3-2000[2]相比，技术内容修订变化较多。本标准实施三年来，新增的嗜肺军团菌检验方法部分内容在实际工作过程中暴露出了诸多的问题，检验机构困惑较多，实际操作也可能出现理解偏差，影响了标准的实施效果。为保证对国家标准的正确理解，完善可操作性，现探讨如下。

1　范围

本章规定“本部分适用于公共场所空气细菌总数、真菌总数、溶血性链球菌以及嗜肺军团菌的测定，其他场所可参照执行。”这里使用“测定”不妥，因为测定是通过测量获得数据，而本标准中对于嗜肺军团菌是定性检验。所以，此处应使用“检验”这个名词[3]。

2　术语和定义

除本标准2.4条对于嗜肺军团菌的拉丁学名应写为“Legionella pneumophila”[4]外，本标准2.5条对“撞击法”的定义：“采用撞击式空气微生物采样器，使空气通过狭缝或小孔产生高速气流，从而将悬浮在空气中的微生物采集到营养琼脂平板上，经实验室培养和得到菌落数的测定方法。”此处定义有误。首先，撞击法的采集载体不仅限于平板，更不仅仅是营养琼脂；其次，撞击法仅仅是一种采样方法，并不包括采样后的实验室检验部分，所以，句末的“经实验室培养后得到菌落的测定方法”与采样法无关，为赘述。本标准6.1条中对嗜肺军团菌的采样方法描述为“液体冲击法”，实际就是撞击法的一种，最终也无法得到菌落数。建议描述为“……将悬浮在空气中的微生物采集到相应培养基中的采样方法”。

3　仪器和设备

本标准6.2.1和6.2.2中分别规定微生物气溶胶浓缩器和液体冲击式微生物气溶胶采样器“对于直径3.0 µm以上粒子的捕集效率应≥80%（或浓缩比≥8）”、“对于0.5 µm以上粒子的捕集效率应≥90%”，目前并没有相应捕集效率的检验方法，实验室无从证实。本标准6.2.3条规定使用50 mL离心管，实际分装采样吸收液的容量为20 mL，为了便于携带至现场采样，建议采用25 mL容量的离心管。本标准6.2.6条对于紫外灯规定波长360 nm±2 nm，实际上一般用于观察微生物菌落荧光的长波紫外灯波长为365 nm，规定为360 nm±2 nm必然给实验室带来困扰。普通光学显微镜、荧光显微镜可用于观察细菌染色形态或军团菌属个别菌种的荧光现象，但在本标准的检验步骤中并未使用这两种显微镜，而且嗜肺军团菌并无自身荧光[4]，故本标准6.2.8条属于赘述。因为后续实验需要各种生化鉴定，比如明胶液化试验需要使用培养箱和冰箱[5]，所以，还遗漏了对于冰箱、恒温培养箱的规定。

4　试剂和培养基

在本标准6.3.3条中，盐酸氯化钾溶液的制备方法存在疑问。“将上述成分混合，用1 mol/L氢氧化钾调整pH 2.2±0.2，121 ℃下高压灭菌15 min备用。”盐酸溶液经过高压灭菌后，氯化氢浓度会有很大的变化，最终pH值不可能是2.2±0.2。鉴于盐酸（0.2 mol/L）pH值约为0.7，1 mol/L氢氧化钾为强碱，细菌都无法存活，建议实验室改变制备方法，氯化钾溶液121 ℃高压灭菌15 min后，直接加入盐酸（0.2 mol/L）3.9 mL混合，再用1 mol/L氢氧化钾调节pH后使用。

本标准6.3.4～6.3.6中规定了分离或鉴定培养基分别为GVPC琼脂平板、BCYE琼脂平板、BCYE CYE琼脂平板。除此处“BCYE CYE琼脂平板”与后续出现的“L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板”描述不符外，作为标准，出现英文缩略语的时候，应该同时标注英文全称，还应明确每一种培养基的具体配方和质量控制要求，否则容易导致误用培养基。如BCYE CYE琼脂平板，该培养基为L-半胱氨酸缺失的BCYE琼脂平板，CYE为活性炭酵母浸出物（charcoal yeast extract）的缩写，半胱氨酸（cysteine）缩写应为CYS，所以，本标准6.3.6条应描述为BCYE-CYS琼脂平板。

本标准6.3.7条革兰氏染色液，该试剂在后续检验步骤中并未使用到，属于赘述。

由于嗜肺军团菌生长营养需求特殊，在没有特殊营养添加的生化反应试剂中，嗜肺军团菌无法正常生长[4]，所以，本标准6.3.8条对于马尿酸盐生化反应管，缺少明确说明应使用特殊营养添加的生化反应试剂。且马尿酸盐水解实验根据实验原理的不同可分为三氯化铁法与茚三酮法，前者适用于链球菌等革兰氏阳性菌，后者适用于弯曲菌等革兰氏阴性菌[6]，此处未加以明确。

本章还遗漏了对于后续采样必备和生化鉴定需要的无菌矿物油、氧化酶、硝酸盐还原、尿素酶、明胶液化等多种生化试验用培养基和试剂的规定。

5　采样

本标准6.4条中存在的问题，除了缺少对于采样过程无菌操作的相应规定外，6.4.4条规定“每个气溶胶样品采集空气量1 m3～2 m3”，首先描述为“每个气溶胶样品”不合适，按照本标准6.6条结果报告和附录A.2条撞击法采样布点要求，应描述为“每个采样点”；关键是此处所界定的应采集的空气量比较随意，最大值为最小值的两倍，标准规定不明确，就可能引起法律纠纷。

本标准6.4.5所描述的“将采样吸收液2（6.3.2）20 mL倒入微生物气溶胶采样器（6.2.2）中，然后用吸管加入矿物油1滴～2滴；在相同采样点重复6.4.3、6.4.4步骤。”此步骤紧接着本标准6.4.2进行，在实际工作中，并不可能购买大量的微生物气溶胶采样器，采样后的吸收液1如何存放，所使用过的微生物气溶胶采样器如何消毒，此处应加以说明。

6　检验步骤

本标准6.5.1条规定“样品的酸处理：对采样后的吸收液1（6.3.1）和吸收液2（6.3.2）原液各取1 mL，分别加入盐酸氯化钾溶液（6.3.3）充分混合，调pH至2.2，静置15 min”。在加入酸处理液后，再测定并调节pH值，操作繁琐，也难以确定具体时间，ISO 11731:2017是将样本1 mL与酸处理液1 : 9混合即可[7]；有报告静置15 min可能影响目标菌检出率[8]，建议实验室将酸处理时间控制在3 min～5 min。

本标准6.5.2条规定“各取悬液0.2 mL～0.3 mL分别接种GVPC平板（6.3.4）”，取样量不同，可能对于检验结果就会产生影响，甚至引起争议。另外，没有明确接种方式。多数检验机构可能选择采用涂布棒进行整个平板表面的涂布，建议先用涂布棒表面涂布半个平板，然后再用接种环在另外半边平板上分区划线，这样可以保证更好的分离效果。

本标准6.5.4条描述的多种菌落颜色，都是对军团菌属的菌落形态描述，并非本标准的目标菌嗜肺军团菌，故如此描述易引起误判，建议实验室通过作业指导书形式细化判断特征。

本标准6.5.5条除两处“半光氨酸”出现书写错误，应为“半胱氨酸”外，规定“从平皿上挑取2个可疑菌落”进行菌落验证，挑取的菌落数量偏少，可能导致漏检。军团菌属中有个别种可在L-半胱氨酸缺失的状态下微弱生长[4]，所以规定“凡在BCYE琼脂平板上生长而在L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长的则为军团菌菌落”不妥，建议描述为“凡在BCYE琼脂平板上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长或微弱生长的则为军团菌菌落”。

本标准6.5.6条规定“应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌”。“生化培养”这种描述欠妥，关键是对于各种生化和血清学试验，具体该如何操作，并没有明确说明。水解马尿酸试验还缺少了最终的判定标准，应为阳性。关于“嗜肺军团菌诊断血清”与本标准6.3.9条“军团菌分型血清试剂”描述不一致。另外，是否能够直接应用目前微生物检验常用的商业化生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定仪，标准未能与时俱进。

7　存在的其他问题

本标准还缺少对质量控制的要求，例如生物安全、标准菌株也应进行规定[9-10]。目前，公共场所系列卫生标准之间不配套的现象仍然亟待解决[11]。如GB/T 18204.6-2013《公共场所卫生检验方法第6部分：卫生监测技术规范》4.9条“公共场所卫生学评价”规定“开展公共场所卫生学评价时，要连续监测3 d，每次监测应采集平行样品”[12]。对公共场所空气嗜肺军团菌检验来说，是否需要采集平行样品，平行样品检验结果不一致的时候如何判定，以符合GB/T 18204.6-2013的明确规定，只能期待标准的下一次修订了。

[1]GB/T 18204．3-2013． 公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物[S]． 北京：中国标准出版社，2013．

[2]GB/T 18204-2000．公共场所卫生标准检验方法[S]． 北京：中国标准出版社，2000．

[3]中国社会科学院语言研究所． 现代汉语词典[M]． 2版． 北京：商务印书馆，1995：109，553．

[4]倪语新，尚红． 临床微生物学与检验[M]． 4版． 北京：人民卫生出版社，2007：72，167-173．

[5]何晓青． 卫生防疫细菌检验-兼论医学细菌分类学基础[M]． 北京：新华出版社，1989：595-596．

[6]王秀茹． 预防医学微生物及检验技术[M]． 北京：人民卫生出版社，2002：907．

[7]ISO 11731：2017，Water quality--Enumeration of Legionella[S]．Switzerland：International Organization for Standardization，2017．

[8]龚瑾，胡必杰，谢红梅，等． 酸处理时间对军团菌生长的影响[J]．药学服务与研究，2008，8（3）：209-212．

[9]GB/T 19489-2008． 实验室 生物安全通用要求 [S]． 北京：中国标准出版社，2008．

[10]CNAS-CL09：2013． 检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明[S]． 北京：中国标准出版社，2014．

[11]周立波，夏海燕，周沼． 关于公共场所卫生标准与检测方法的问题探讨 [J]． 中国民康医学，2007，19（12）：488．

[12]GB/T 18204．6-2013． 公共场所卫生检验方法 第6部分：卫生监测技术规范[S]． 北京：中国标准出版社，2013．