锁阳对运动性肾缺血再灌注损伤大鼠肾脏炎症因子的影响

孙晓琴，邱东海，周海涛，谭贡霞，刘江波，张 静

（1.赣南医学院，江西 赣州 341000；2.北京联合大学，北京 100023）

中医认为，过度的运动训练可导致元气耗损，元气的损耗是机体出现力竭的主要原因。同时，长时间、大强度训练产生的疲劳，初期伤脾，受训练时间、运动强度、恢复时间等因素的影响，久之则会伤肾。肾藏精，精化气，肾气作为生气之源，是生命力活动的原动力。研究表明，剧烈运动状态下，机体内正常的血流分布受运动应激影响被打破，相关器官中的血流量发生了重新的分布，在肌肉等运动器官中聚集了大量的血液，内脏尤其是肾脏中的血流量，伴随着运动时间的持续进行和运动强度的不断增加出现大幅下降，进而引发“运动性肾缺血”。而当运动完全停止后，大量的血液重新回流到肾脏，运动及恢复期肾血流量则引发了肾脏的进一步损伤。肾脏对缺血及缺血再灌注损伤表现的异常敏感，2个时相肾血流量的改变在运动性肾缺血再灌注损伤的整个过程中发挥着重要的作用 。肿瘤坏死因子-α（Tumour necrosis factor-α，TNF-α）等一系列炎症细胞因子在运动性肾缺血再灌注损伤中发挥着重要作用。 中药对过度训练引发的运动性脏器损伤的保护作用已引发了全球运动医学及运动营养领域专家、学者的高度重视。已有研究表明，锁阳具有抗应激，抗疲劳、抗氧化、清除自由基、提高过氧化物歧化酶活性、降低脂质过氧化物的药理作用。故本实验选用锁阳对过度训练大鼠进行营养干预，观察其是否可以对过度训练诱导的肾脏缺血再灌注损伤大鼠肾脏组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18蛋白表达发生影响，从而减轻了肾脏的组织病理学改变，延缓或避免对肾脏的损害。

1 材料与方法

1.1 实验动物

7周龄72只清洁级雄性Wistar大鼠。

1.2 实验用药

锁阳，产地甘肃，购自北京同仁堂药店，批号：160925351。

1.3 动物分组与训练及测试方案

72只大鼠以数字随机分组法分为安静对照组（C组，12只）、一般训练组（M组，12只）、过度训练组（OM组，24只）和锁阳干预+过度训练组（CM组，24只）。CM组每天灌胃1次，剂量为4.5 g.kg-1（预实验得出最佳剂量），体积为5 mL.kg-1，其他组等量的生理盐水。C组大鼠以常规方式进行饲养，不进行任何运动和营养干预。M组大鼠以中等强度进行为期6周的游泳训练（无负重），每周训练6天，每天训练1次。训练时间由20min递增至120min。CM组和OM组则进行6周的递增负荷力竭游泳训练，每次训练均至力竭。负重量由1%逐渐递增，至第6周负重量递增至5%的体重，1天2训（上、下午各1次）。力竭标准以大鼠下沉后10 s仍无法露出水面为准。C、M组大鼠未出现意外性死亡；CM组和OM组大鼠在训练过程中受多种因素影响，部分大鼠出现意外死亡。训练结束时，CM组仅剩余12只大鼠，OM组仅剩余10只大鼠。

1.4 指标测定

末次游泳训练24h后，各组大鼠以乙醚进行适度麻醉后，自颈总动脉取血5mL，37 ℃自然凝固，待血清出现后，放入冰箱24h后，4℃下3 000 r.min-1离心10 min后取上清液，置于-20℃冰箱中保存。剖腹后迅速取双肾，剔除筋膜，置于预冷的生理盐水中洗净血污后，观察肾脏大小、色泽、质地，切取肾组织，以经过消毒的铝箔包好，投入液氮暂存，随后冻存于-70℃冰箱待测 。

根据试剂盒说明采用测定相关指标：血清肌酐（Jaffe苦味酸法），血清尿素氮（二乙酰-肟法），肾组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18蛋白表达（免疫组织化学法）。相关试剂盒购自北京利德鸿奥科技有限公司。

1.5 肾脏病理变化、免疫组化结果半定量积分评价

参照Pallers标准及染色程度和范围（着色范围参照Riera等标准 ）分别进行肾脏病理变化和免疫组化结果半定量积分评价。

1.6 统计学分析

采用SPSS19.0软件对相关数据进行分析、处理，数据以平均数±标准差（）表示，组间差异采用方差分析，等级计数资料采用秩和检验分析。以P＜0.05为显著性水平，P＜0.01为非常显著性水平。

图1 4组大鼠肾组织病理（HE，×400）

2 结 果

2.1 不同组别大鼠肾组织的病理学改变

从图1可知，光镜下C组、M组大鼠肾组织形态均没有出现异常，肾小球和肾小管未发生淤血、变性和水肿，肾小管管腔中未发现管型。OM组大鼠肾小球出现明显的淤血现象，小管上皮细胞出现水肿、空泡变性及管腔扩张，管腔中有少量脱落的绒毛和上皮细胞及各种管型。CM组组织病理学改变较OM组存在明显的改善。大鼠肾小球出现轻微的小管上皮细胞水肿、空泡变性，管腔扩张现象，无蛋白管型和细胞管型。肾小管Pallers评分，C组、M组组间无显著差异（P＞0.05），OM明显高于C组（P＜0.01），CM组显著低于OM（P＜0.05）（表1），且均未见肾小球2.2不同组别大鼠血清尿素氮和肌酐水平比较

表1 不同组别大鼠肾小管损害评分比较

表2 不同组别大鼠血清尿素氮和肌酐水平比较

表3 不同组别大鼠肾组织IL-1β蛋白表达水平比较

表4 不同组别大鼠肾组织IL-6蛋白表达水平比较

表5 不同组别大鼠肾组织TNF-α蛋白表达水平比较

表6 不同组别大鼠肾组织IL-18蛋白表达水平比较

2.2 不同组别大鼠血清尿素氮和肌酐水平比较

从表2可知，C、M组间血清尿素氮和肌酐水平无显著性差异（P=0.103，P=0.118，P＞0.05）；OM组显著高于C组（P=0.006，P=0.003，P＜ 0.01）；CM组显著低于 OM 组（P=0.031，P=0.028，P＜0.05）。

2.3 不同组别大鼠肾组织相关炎症因子蛋白表达水平比较

从表3～表6可知，C、M组大鼠肾脏组织IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α蛋白仅有轻度表达，且组间不存在显著性差异（P＞0.05）；OM组与C组间存在差异（P＜0.01或P＜0.05）；CM组较OM组有所缓解（P＜0.05）。

3 讨 论

近年来有研究表明：肾脏组织炎症因子的表达水平有效地反映运动性肾缺血再灌注损伤程度 。本实验采用6周的递增负荷力竭游泳训练的训练方式，运动性肾缺血再灌注损伤动物模型造模成功。大鼠肾脏组织相关炎症因子的蛋白表达上调，引发了肾脏的炎性作用的大幅度增强，极大地损伤了肾脏功能，同时也引发了肾脏组织出现显著的病理学改变；而采用适宜运动训练方式的大鼠肾脏组织相关指标未发生显著性改变，说明适度的运动训练不会破坏肾脏组织中促炎因子与抑炎因子间的动态平衡引发炎性作用，对肾功能不会造成损伤，组织结构未发生病理学改变。锁阳干预组大鼠肾脏组织相关炎症指标、肾脏功能指标较过度训练组有明显改善，表明采用锁阳对大鼠进行营养干预，可以有效地抑制运动性肾脏缺血再灌注损伤中相关炎性因子的过度表达，确保了正常的肾脏功能组织结构。其机制可能为：锁阳通过有效地提高机体内多种抗氧化酶的活性，清除大强度运动产生的过量的自由基，抑制脂质过氧化作用的发生与发展及炎性细胞因子的过度生成与表达，确保了肾脏组织细胞膜的完整性、稳定性和通透性，减轻对肾脏功能和组织结构的损伤及机体的免疫机能。其机制可能为：（1）锁阳富含的黄酮类、三萜类、多糖等多种活性物质具有较高的抗氧化活性，可以提高超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，降低脂质过氧化物的浓度，清除体内过量自由基 ；（2）锁阳中含有的维生素E可以有效地减轻脂质过氧化反应，清除自由基。（3）锁阳中含有的乙酸等酸性物质较油脂更容易失去H.，可以有效地推迟和缓解脂质的氧化，终止油脂氧化链式反应的传播，起到挥抗氧化剂的作用。

4 结 论

锁阳通过抑制炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18表达，明显地减轻运动性肾缺血再灌注引起的肾功能障碍和肾脏组织病理学改变。

[1]Bergamaschi C T， Boim M A， Moura LA. Effects of long-term training on the progression of chronic renal faiture in rats[J ].Med Sci Sports Exerc 1997，29（2）：169-174.

[2]Vlassara H，Torreggiani M，Post J B，et al. Role of oxidants/inflammation in declining renal function in chronic kidney disease and normal aging[J ].Kidney Int Suppl，2009，114： S3-11.

[3]齐艳华，苏格尔.锁阳的研究进展.[J ].中草药，2000，31（2）：146-148.

[4]周海涛，曹建民.补益中药对运动性肾缺血再灌注损伤大鼠的保护作用[J ].中国运动医学杂志，2013，32（6）：518-524.

[5]Paller MS，Hoidal JR，Ferris TF. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat. Jacrd of Clinical Inuestigation[J ].1984，74（4）：1156-1164.

[6]Riera M，Torras J，Cruzado JM，et al.The enhancement of endogenous cAMP with pituitary adenylates olypepyide protectsrat kidney against ischemia through the modulation of inflammatory response[J ].Transplantation，2001，72（7）：1217- 1223.

[7]郭林.大负荷训练导致大鼠肾组织微细结构变化和分子调控机理的探讨[D ].北京：北京体育大学，2005：68-79.

[8]Flaws JA，Hirshfield AN，Hewitt JA，et al. Effect of bcl-2 on the primordial follicle endowment in the mouse ovary.[J ].Biol Reprod，2001，64（4）：1153-1159.

[9]石旦，何小舟，徐海燕，等.肾缺血再灌注损伤及其保护的研究进展. [J ].医学综述，2009，15（18）.

[10]罗军德，张汝学，贾正平.锁阳抗缺氧活性部位的药理作用及机制研究. [J ].中药材，2006，29（7）：743.