茶树内生菌研究进展

乔新荣

(信阳农林学院 生物与制药工程学院，河南 信阳464000)

植物内生菌(Endophytes)是指部分生活史或全部生活史生活在健康植物组织细胞间隙，又不引起宿主植物明显病害的微生物，包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌。自1898年Vogi从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，人们发现植物中存在大量的有价值的具有生理活性的内生菌。近些年来，植物内生菌作为一类新的天然药物的微生物开发资源受到了广泛的关注，并已成为国内外研究的一个热点。茶树(Camellia sinensis)属于药用植物，茶叶的次生代谢物茶多酚、茶碱、有机酸、杀菌物质等, 具有兴奋解倦、消食去痰、解毒止渴、利尿明目、补充营养等功效。茶叶是一种天然保健饮品，被称誉为21世纪的健康饮料，当今全球有近半数人饮茶。因此开展茶树内生菌的研究，对防治茶树病虫害、提高茶叶的保健功能、开发新药、降低药物毒副作用等方面提供了一种新的手段。本文综述了茶树内生菌的分离方法、分布特点、优势菌群以及生物学作用，为进一步研究、开发茶树内生菌资源提供依据。

1　茶树内生菌的分离

1.1　茶树内生真菌的分离方法

茶树内生真菌分离的关键步骤是茶树组织块的表面消毒。研究表明，次氯酸钠是最合适的表面消毒剂，并与酒精相结合,建立起一般性表面消毒的流程。张婉婷和张灵枝[1]优化茶树成熟叶片的分离条件为：先用75%乙醇浸泡1min，然后用3%的次氯酸钠浸泡5min, 再用75%乙醇浸泡1min，最后用无菌水漂洗3次。而杨冠英[2]优化叶的表面消毒方法为：首先75%的乙醇消毒 2min，5.2%的次氯酸钠消毒 20s，最后用无菌水漂洗4次。茶叶表面消毒后，选用PDA培养基培养真菌，都达到了较好的分离效果。同时，杨冠英探索茶树茎的表面消毒：75%乙醇 2min → 5.2%次氯酸钠5min → 无菌水漂洗4次[2]。陈晖奇[3]消毒茶树组织块：70%乙醇60s → 3.5%次氯酸钠4min → 70%乙醇30s → 无菌水冲冼3次，也能分离出茶树内生真菌。

1.2　茶树内生细菌的分离方法

茶树内生细菌的分离大多采用乙醇与升汞或乙醇与次氯酸配合进行表面消毒，消毒后的组织块研磨后，分离内生细菌。例如洪永聪[4]取茶树叶片1.0g，先用70%乙醇浸泡5min，再用0.2%升汞表面消毒2～3min，最后无菌水冲洗3次。晾干后的样品无菌条件下加5mL无菌水研磨匀浆，静止15min后，各取50μL涂平板，计算菌落数。而有些研究表明叶片用0.1%升汞表面消毒3～5 min[5]，或采用2%～3%的次氯酸浸泡处理10min[6]，用10%的次氯酸浸泡10min分离主根与侧根中的内生细菌也达到了比较好的效果[6]。

2　茶树内生菌的分布特点

2.1　茶树内生菌分布的多样性

同其他植物一样，茶树内生菌的分布具有多样性和普遍性。陈晖奇[3]从994 个不同的茶树组织块中分离出 553个真菌菌株，且同一茶树叶片中可分离到3～6种内生真菌。游见明[8]从茶树的根、茎、叶中分离得到 143 株内生真菌，鉴定为 14 个属。张宇玲等[9]从茶树品种黄旦、铁观音中分别分离到18个、15个形态型的内生真菌，其大多数为半知菌和子囊菌，少数为担子菌。

2.2　季节影响内生菌的分布

王明好[10]研究豫南地区茶园的茶树内生真菌表明，季节影响茶树内生真菌种类的分布，表现为夏、秋、冬、春季的内生真菌种数依次呈递增趋势。李小容[11]对福建茶园的研究揭示5月份、10月份分离获得的真菌种类较为丰富，二月分离的较少，这与王明好的研究结果不同，可能是由于不同的茶树品种及不同的生境导致，具体原因需进一步研究。另外，徐焰平[12]详细研究了茶树芒果球座菌(Guignardio mangiferae)在一年之中的分布规律，结果表明 2～4月及6月其分布较少，而5月、7～8月和12月是其分布的高峰期。

2.3　叶龄影响内生菌的分布

谢丽华[13]研究结果表明叶片中内生真菌的数量与叶龄呈正相关，进一步分析揭示茶树中内生真菌的分离频率与茶多酚含量呈负相关，而茶多酚的含量却随着叶片的成熟而下降，推测茶树叶片的化学成份含量是影响内生真菌分布的重要因素之一。陈晖奇[14]等的研究结果表明，幼叶主要分布内生细菌，分离比例占65%，而成熟叶片中主要分布内生真菌,分离比例占93.88%。在茶树叶片成熟过程中，呈现内生细菌渐减，而内生真菌逐渐增多的较有规律的内生菌种类演替。徐焰平[12]分离了不同季节茶树扦插苗、实生苗、种子、落叶和叶片等组织中的芒果球座菌，结果表明新抽出的嫩叶芽中没有芒果球座菌分布，随着叶龄的增长成熟，其分离频率逐步提高，在老叶中高达至73.5%。

2.4　茶树品种影响内生菌的分布

谢丽华[13]研究表明茶树品种黄旦的内生真菌分离频率达100%，而福云六号只有7.5%。朱育菁[15]对采自福建宁德地区的大白毫和福云六号茶叶进行内生菌的分离，鉴定大白毫带有红杆菌属、微杆菌属、根瘤菌属和贪噬菌属的内生细菌, 而福云六号仅含有根瘤菌属和贪噬菌属。徐焰平[12]的研究结果揭示茶树品种是影响芒果球座菌分布的重要因素。同一环境两茶树品种之间优势真菌种类大致相同，但数量上存在差异[11]。这些研究结果表明茶树品种不同或遗传背景不同，其内生菌的分布及种类存在明显差异。

3　茶树内生菌的优势菌群

不同地区的茶树，内生真菌优势菌群种类也不同。广东茶区的优势内生真菌分别是拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.)、球座菌属(Guignardia sp.)[11]。福建茶区的优势内生真菌属于球座菌属、拟盘多毛孢属、刺盘孢属(Colletotrichum spp.)、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)和黑曲霉(Aspergillus niger)[3，13，16]。豫南茶区的优势内生真菌鉴定为刺盘孢菌属、大茎点霉属(Macrophoma sp.)、拟茎点霉属(Phomopsis sp. )[10]。内生真菌和茶树长期共生，协同进化，他们之间的互作关系受茶树所含化学成分变化的影响。因此，不同茶区的内生菌的优势菌群的差异暗示着茶树的某些次生代谢产物的不同，深入探讨优势菌群的作用机制将会为不同茶区茶叶的品质差异及特色风格提供理论依据，同时为开发茶树内生真菌资源提供一定的基础。

4　茶树内生菌的生物学作用

4.1　影响茶树的代谢产物积累

武汉琴[16]分离到1株促进茶树组培苗生长的内生真菌，编号为CSN-18，属于长枝木霉(Trichoderma longibrachtatum)。通过接菌和对照茶苗代谢产物含量的比较，发现CSN-18菌株影响宿主代谢产物茶多糖、儿茶素类及咖啡碱的含量。戴清良[17]研究表明内生炭疽菌促进了茶叶中多酚类物质的积累，对茶叶的生化代谢产生了一定的影响，而且一些茶树内生真菌自身也能产生茶多酚，进一步揭示了茶树内生真菌产生了与宿主相同的代谢产物。另外，曾如意[18]的研究结果则表明芒果球座菌增强了茶多酚的分解能力。

4.2　具有抑菌作用

戴清良[17]研究表明茶树内生球座菌和FHM菌的代谢产物对白色念珠菌(Candida albicans)都有抑制作用，且内生真菌FHM代谢产物对炭疽菌、拟盘多毛孢菌、球座菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等也有明显的抑制作用。陈丹[19]从茶树内生真菌芒果球座菌菌落表面分离到一株放线菌命名为BF-01，其为链霉菌属卡伍尔链霉菌(Streptomyces cavourensis subsp)放线菌，具有广谱抑菌性，且BF-01菌株的发酵液中含有两种生物碱类杂环化合物，其具有很高的农药医药等应用价值。将BF-01菌与内生真菌芒果球座菌混合发酵培养建立复合菌系,以稻瘟菌为敏感指示菌,混合发酵液的抑菌效果比单培养显著提高[20]。戴清良[19]的研究表明茶树内生真菌木霉和曲霉的混合发酵的代谢产物抑菌活性高，对茶花褐斑病菌的抑制率高达80.82%。谢丽华[13]从茶树根部分离获得的一株内生青霉菌对茶叶的病原菌及黑曲霉有较强的抑制作用，其发酵液对其它7种病原菌也都有一定的抑制作用。洪永聪[14]从福建茶树中分离到一株枯草芽孢杆菌菌株TL2，其具有较强的内生定殖能力、拮抗能力强且拮抗谱广，对茶轮斑病的抑制及氯氰菊醋的降解作用都强。曾如意[18]分离纯化得到的一株炭角菌属(Xylaria sp.)的真菌菌株(编号为Ic112517)进行培养，它产生的多酚类和过氧化氢等化合物，对芒果球座菌有一定的抑制作用。李绍锋和杨民和[21]分离了一株淡紫拟青霉内生真菌，通过对峙培养和发酵液的抑菌试验研究表明，该菌株对7种茶树内生真菌和10种植物病原菌均有较强的抑菌作用，其发酵液对供试的16 种真菌具有不同程度的抑制作用。此外，黄晓琴[22]等从茶树内生菌中鉴定了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌株，将有利于冰核细菌生物防治的开展。朱育菁[15]从7份茶叶样品中共分离到16株细菌、1株真菌，其中有11株内生菌抑制了10种供试病原菌的生长, 其中放射根瘤菌Eb659菌株具有广谱抗菌作用，具有作为开发生防菌防治植物病害的潜力。

4.3　产色素作用

微生物色素可作为天然色素, 可用于食品、医药、轻工业等领域。卢东升[23]等从健康茶树的成熟叶片中分离的一株不产孢内生真菌H8菌株, 该菌株为镰刀菌属( Fusarium )真菌, 其有性型为子囊菌，其菌丝可产生大量红色色素, 所产色素性质稳定。

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5　结语

众所周知，茶叶具有一定的药理和保健作用，但茶叶化学成分复杂，有效成分含量低。开发茶树内生菌是提高茶树活性成分含量和产量的有效手段之一。许多学者现已对茶树内生菌的分离方法、分布规律、不同地区优势菌种的鉴定、生物学作用等方面进行了研究和探讨，但还不够深入，不够系统化。如内生真菌与茶树活性成分生物合成之间关系的研究尚缺乏一定的深度；从细胞水平和分子水平探究内生真菌的代谢调控机制还很少等。随着科学技术的发展，将综合利用植物药学、微生物学及分子生物学等领域的研究理论和方法，深入探讨茶树内生菌次生代谢产物转化为茶叶活性成分的生物学机制，并利用内生菌易繁殖的特点，满足市场对茶叶药用活性成分的需求。