NKp46-Cre介导的YFP报告基因系统标记小鼠NK细胞的特异性和效率检测

于明航 ，李 杨 ，阎 晗 ，王 瑾 ，黄 珊 ，袁顺宗 ，尹 洁 ，李泽兴 ，王 玺

（1.天津医科大学细胞生物学系，天津300070；2.中国人民解放军307医院头颈肿瘤科,北京100853）

自然杀伤细胞（natural killer cells，NK cells）是机体进行免疫防疫的第一道防线，主要是抵抗细菌、真菌、病毒以及病原微生物的入侵[1-3]，同时NK细胞在抗肿瘤免疫方面也扮演着重要的角色[4-6]。但是NK细胞在发育和功能等方面还有许多的未知机制。利用转基因小鼠研究NK的发育与功能是一个

非常有效的工具。NKp46-Cre转基因小鼠是对表达NKp46受体的NK细胞进行特异性敲除的工具鼠[7-8]。在本次研究中，主要是利用ROSA26R-YFP小鼠与NKp46-Cre小鼠杂交，通过对小鼠体内细胞YFP的表达验证NKp46-Cre的敲除效率以及是否具有特异性，目的是构建YFP基因报告系统，为进一步研究NK细胞的功能与发育做好基础。

1 材料与方法

1.1 材料 ROSA26R-YFP转基因小鼠（哈佛医学院惠赠），NKp46-Cre转基因小鼠（中国解放军307医院袁顺宗老师惠赠）；鼠尾碱性裂解液（25 mmol/L NaOH；EDTA．Na20．2 mol/L），鼠尾酸性中和液（Tris-HCl 40 mmol/L，pH=5）Tag DNA 聚合酶（康成）；普通PCR 仪（ABI）；流式细胞仪（BD）；Percific Blue-CD3e（BD），APC-CD19（BD）；PE-NKp46（BD）；引物由北京奥科合成，引物序列见表1。

表1PCR引物Tab 1 PCR primers

1．2 实验方法

1．2．1 基因型鉴定 ROSA26R-YFP（+/-）小鼠与NKp46-Cre（+/-）小鼠杂交，子代在出生25 d左右进行耳标编号，并剪鼠尾进行基因型鉴定。将鼠尾浸泡含有75 μL的碱性裂解液的离心管中，将离心管置于100℃金属水浴锅30 min；冰上裂解5 min；5 min后向样品中加入75 μL的酸性中和液并将鼠尾吹打均匀，Nanodrop 2000测浓度；按照Tag DNA聚合酶试剂盒进行配制PCR体系；95℃10 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃10 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳进行，结束后在凝胶成像仪中记录结果。

1．2．2 流式细胞术检测各个组织器官YFP的表达 颈椎脱臼法处死ROSA26R-YFP（+/+）NKp46-Cre（+/-）和 ROSA26R-YFP（-/-）NKp46-Cre（-/-）的小鼠，分别取两种小鼠的脾脏、骨髓、淋巴结和心脏，将组织在1640培养基中研磨，用细胞筛网过滤，制成单个悬浮细胞，通过细胞计数，选取1×106个细胞进行流式上机，最后用FlowJo软件进行分析。

1．2．3 流式细胞术检测脾脏中各个免疫细胞的YFP的阳性效率 按1．2．2的方法提取脾脏的淋巴细胞；将YFP双阳性的带有NKp46-Cre的小鼠淋巴细胞每1×106个细胞制成单个悬浮细胞于3个管，分别标记 CD3、CD19、NKp46；分别加入1μL 抗体标记的 Percific Blue-CD3e，APC-CD19，PE-NKp46，并且每管都加入1 μL NKp46的抗体，室温避光30 min；300g，5min离心收集细胞，最后用 300μL 的PBS重悬，另外需要一个含有2×106个细胞Negative管，500 μL PBS重悬，最后将样品转入流式管，准备流式上机，最后用 FlowJo（7．6）软件进行分析。

1．3 统计学方法 采用SPSS20．0软件进行统计分析。符合正态分布的计量数据用±s表示，2组间样品均数比较采用独立样本t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 基因型鉴定 ROSA26R-YFP（+/-）小鼠与NKp46-Cre（+/-）小鼠杂交后代共有14只小鼠，提取基因组DNA并进行基因型鉴定。已知YFP野生型的PCR条带为600 bp（YFP-），而YPF阳性的PCR条带为320 bp（YFP+），Cre野生型的PCR条带为454bp（Cre-），而YPF阳性的PCR条带为282bp（Cre+），基因型结果鉴定见图1、表2。根据表格选择对照组和实验组。

图1ROSA2R-YFP(+/-)与NKp46-Cre（+/-）杂交小鼠后代基因型鉴定结果Fig 1 The YFP genotyping results of the hybrid mice ROSA26RYFP(+/-)and NKp46-Cre（+/-）

表2ROSA2R-YFP(+/-)与NKp46-Cre（+/-）杂交小鼠后代基因型鉴定结果Tab 2 ThegenotypingresultsofthehybridmiceROSA26R-YFP(+/-)and NKp46-Cre（+/-）

2.2 各个组织器官中YFP阳性的表达 流式细胞术检测根据基因型鉴定结果分成的实验组ROSA26R-YFP(+/+)NKp46-Cre（+/-）和对照组ROSA26R-YFP(-/-)NKp46-Cre（-/-）小鼠的免疫器官（脾脏、淋巴结、骨髓）和非免疫器官（心脏）中细胞YFP阳性的表达，见图2。双阳性小鼠淋巴结、骨髓、脾脏中YFP的阳性细胞数百分比分别为0.589%±1.02%、1.89%±1.28%、4.53%±1.54%；阴性对照 YFP（-/-）Cre（-/-）小鼠相对应的器官 YFP 阳性百分比分别为0.008%±0.003%、0.126%±0.08%、0.12%±0.004%；与对照组相比均有统计学差异。两组小鼠的心脏细胞中基本没有YFP的表达，其中YFP的表达百分比分别为 0.009%±0.0002%、0.03%±0.012%，两组之间没有明显统计学差异。NKp46-Cre介导的YFP的表达在免疫器官中具有特异性。

图2 免疫器官（淋巴结、骨髓、脾脏）和非免疫器官（心脏）的YFP表达情况Fig 2 The expression levels of YFP in immune organs and non-immune organs

2.3 脾脏淋巴细胞系中YFP阳性的表达效率 流式细胞术检测ROSA26R-YFP(+/+)NKp46-Cre（+/-）小鼠脾脏中淋巴细胞系（T cells、B Cells、NK cells）的YFP标记阳性细胞的百分比。ROSA26R-YFP阳性细胞标记NK细胞、T细胞、B细胞的百分比，分别为89.4%±1.08%、0.89%±0.56%、0.82%±0.82%，在各种细胞中差异均有统计学意义，说明NKp46-Cre系统介导的YFP荧光报告系统可以准确代表小鼠体内的NK细胞（图3）。

图3 免疫器官脾脏淋巴细胞系中YFP的表达情况Fig 3 The percentages of YFP in spleen lymphocyte lineage of immune organ

3 讨论

自然杀伤细胞是固有免疫系统中一类重要的免疫细胞，它主要分布于次级淋巴组织器官以及外周血中[9-11]，NK细胞不像T细胞，它不需要预先致敏就能发挥杀伤作用或分泌细胞因子、趋化因子等能力[12-14]。截止到目前为止，对NK细胞的发育分化以及功能方面的调控仍然存在很多的未知，而现在转基因小鼠的应用，对于NK细胞的进一步研究提供了非常有效的工具。

NKp46-Cre转基因小鼠是一种专门介导表达NKp46受体的NK细胞的敲除小鼠[7]。现阶段，Cre重组酶介导的基因敲除检测主要集中在基因组的基因型鉴定，RT-PCR以及Western等技术在DNA、mRNA和蛋白水平上进行验证，而这些实验对于做免疫功能实验较为困难，并且不利于活体实验的研究。因此，在本次实验中引入了ROSA26R-YFP荧光报告基因小鼠与NKp46-Cre小鼠杂交，借助Cre重组酶系统切除ROSA26R-YFP荧光报告基因前面的终止子从而表达YFP蛋白[15]，形成观察NK细胞的一种有效手段。

在本次实验中，我们得到了ROSA26R-YFP（+/-）或ROSA26R-YFP（+/+）的NK细胞，并且在各个免疫器官（脾脏、淋巴结、骨髓）中得到YFP的阳性表达，证实了YFP阳性NK细胞的阳性表达率在80%以上，而在ROSA26R-YFP（+/+）纯合的小鼠中的阳性率更高达90%左右。虽然YFP标记NK细胞并不是100%，可能还是与Cre重组酶的敲除效率有关，但其结果证实YFP阳性细胞可代表NK细胞，为了以后进一步的研究我们会采取ROSA26R-YFP（+/+）纯合的小鼠进行实验。

综上所述，本次实验结果表明YFP基因报告系统可行，在以后的实验中可以选择YFP阳性的细胞进行实验，对NK细胞的发育进行实时监测，有利于分析NK细胞的分化和增殖，而对于功能方面利用YFP阳性细胞进行杀伤实验，也有着重要的作用，因此，这个系统的建立可以更加深入地探讨NK细胞地发育和功能方面的问题，为免疫细胞的研究提供了方向。

[1] Zhang C,Tian Z.NK cell subsets in autoimmune diseases[J].J Autoimmun,2017,83:22

[2] Post M,Cuapio A,Osl M,et al.The Transcription factor ZNF683/HOBIT regulates human NK-cell development[J].Front Immunol,2017,8:535

[3] Holmes M L,Huntington N D,Thong R P,et al.Peripheral natural killer cell maturation depends on the transcription factor Aiolos[J].EMBO J,2014,33(22):2721

[4] Bollino D,Webb T J.Chimeric antigen receptor-engineered natural killer and natural killer T cells for cancer immunotherapy[J].Transl Res,2017,187:32

[5]Sun J C,Lanier L L.NK cell development,homeostasis and function:parallels with CD8(+)T cells[J].Nat Rev Immunol,2011,11(10):645[6] Lopez-Soto A,Gonzalez S,Smyth M J,et al.Control of metastasis by NK cells[J].Cancer Cell,2017,32(2):135

[7] Narni-Mancinelli E,Chaix J,Fenis A,et al.Fate mapping analysis of lymphoid cells expressing the NKp46 cell surface receptor[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(45):18324

[8] Deng Y,Kerdiles Y,Chu J,et al.Transcription factor Foxo1 is a negative regulator of natural killer cell maturation and function[J].Immunity,2015,42(3):457

[9] Male V,Brady H J.Transcriptional control of NK cell differentiation and function[J].Curr Top Microbiol Immunol,2014,381:173

[10]Moretta L,Montaldo E,Vacca P,et al.Human natural killer cells:origin,receptors,function,and clinical applications[J].Int Arch Allergy Immunol,2014,164(4):253

[11]Paolini R,Bernardini G,Molfetta R,et al.NK cells and interferons[J].CytokineGrowthFactorRev,2015,26(2):113

[12]Levy E M,Roberti M P,Mordoh J.Natural killer cells in human cancer:from biological functions to clinical applications[J].J Biomed Biotechnol,2011,2011:676198

[13]Hsu H T,Mace E M,Carisey A F,et al.NK cells converge lytic granules to promote cytotoxicity and prevent bystander killing[J].J Cell Biol,2016,215(6):875

[14]Leavy O.Maturation and function of NK cells[J].Nat Rev Immunol,2012,12(3):150

[15]Guan C,Ye C,Yang X,et al.A review of current large-scale mouse knockout efforts[J].Genesis,2010,48(2):73