气相色谱法测定月见草子中γ-亚麻酸的含量

徐彤彤 刘治民 邢潇 张航 梁玉冰 杨建龙

摘  要：采用气相色谱法测定月见草子中γ-亚麻酸的含量。采用HP-INNOWAX毛细管色谱柱（40～260℃，30m×320μm×0.50μm）、FID 检测器，载气为N2，纯度99.999%程序升温（初始温度150℃，保持5min然后以5℃/min速度升至240℃保持10min）;分流进样进样（20：1）;进样口温度为250℃;检测口温度为260℃，以外标法测定月见草子中γ-亚麻酸的含量。γ-亚麻酸在HP-INNOWAX毛细管色谱柱（40～260℃，30m×320μm×0.50μm）上具有较好的分离效果，其分离度为2.67。γ-亚麻酸的线性范围为1.2～7.2 mg/min （R2=0.9999） ; γ-亚麻酸平均回收率（ n = 9）为92.4%，RSD 为0.4%。结论：所建立的方法简单、准确、可靠，可用于月见草子的质量控制。

关键词：月见草子;气相色谱;γ-亚麻酸;含量测定

中圖分类号：S-3                               文献标识码：A                                          DOI：10.11974/nyyjs.20181131007

月见草子为柳叶菜科植物月见草Oenothera biennis L.的干燥成熟种子。俗称山芝麻、夜来香、东风草等。夏末、秋季果实成熟时采收，剪（割）果序，或全株拔起，晒干，压或敲打，收集种子，除去杂质，即得。常见为月见草油的原料药[1]。

虽然月见草子在市面流通广泛，但尚未有对其有效成分进行含量控制，因此为完善药材质量的安全、稳定、有效、可控，考虑采用气相色谱法对月见草子中主要成分γ-亚麻酸进行含量测定[2-3] ，并为月见草子的质量控制提供科学依据。

研究表明月见草子含有生物碱、氨基酸、不饱和脂肪酸（棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸）、蛋白质等，γ-亚麻酸为其月见草子的主要药效成分[4-5]，具有防止血脂沉积、抑制血小板集聚的作用，可作抗血栓剂，营养补充剂。由于γ-亚麻酸对照品不稳定难于购买，因此采用甲酯化法把其转化成衍生物γ-亚麻酸甲酯进行含量测定。

1     仪器与试药

Agilent 7890A 气相色谱仪及工作站（氢火焰离子化检测器FID）;载气为高纯氮气（ 大于99.999%）;HP-INNOWAX毛细管色谱柱（40～260℃，30m×320μm×0.50μm）。

γ-亚麻酸甲酯对照品：中国食品药品检定研究院，批号： 121134-200001，纯度93.7%;水：超纯水;12批月见草子药材均采收于吉林省各地，经长春中医药大学张景龙教授鉴定，具体来源见表1。

2     方法与结果

2.1     色谱条件

采用HP-INNOWAX（40～260℃，30m×320μm×0.50μm）毛细管柱; FID检测器;程序升温;150℃恒温5min后，以5℃/min速度升至240℃，保持10min检测器温度为260℃，进样口温度为250℃;分流比为20：1;氮气：3mL/min（纯度99.99 %）、氢气：30mL/min （纯度99.99 %）、空气350mL/min。进样量：1.0μL。

2.1.1     对照品溶液的制备

取γ-亚麻酸甲酯对照品适量，精密称定，加石油醚（30～60℃）制成浓度为4μg/mL的溶液，即得。

2.1.2     供试品溶液的制备

取样品粉末（过三号筛）约4g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚（30～60℃）适量加热回流（8h）至脂肪油提尽，收集提取液，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上低温蒸干，在100℃干燥1h，移置干燥器中，冷却30min。取脂肪油约100mg，精密称定，于5mL量瓶中，加入2.0mL 石油醚（30～60℃）溶解， 然后边振荡边滴加氢氧化钾-甲醇溶液（1mol·L-1）1.0mL，密封， 继续振荡1min 后， 静置10min， 加适量盐酸溶液至中性， 混匀，加石油醚（30～60℃）至刻度，混匀，离心， 移取上层于另一试管中， 加入无水硫酸钠， 制成供试品溶液。滤过，取续滤液，即得[6]。

2. 2     专属性试验

在上述色谱条件下，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液与阴性样品各1μL，注入气相色谱仪，记录色谱图（ 见图1） 。结果表明，阴性样品与样品、对照品相应保留时间处未出色谱峰。对照品溶液、供试品溶液的色谱图见图1。由图1 可见，各色谱峰均达到基线分离，对映γ-亚麻酸甲酯的分离度为2.67，符合中国药典要求;理论板数按γ-亚麻酸甲酯计算应不低于5000 [7，8]。

（a）对照品;（b）样品;（c）色谱图

2.3     线性关系考察

对照品贮备液精密称取120.60mgγ-亚麻酸甲酯对照品至10mL容量瓶中，加正己烷至刻度，配制成12.06mg/mL的对照品溶液，摇匀，备用。

分别吸取母液 γ-亚麻酸甲酯：0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL，至5mL容量瓶中， 加正己烷至刻度，记录γ-亚麻酸甲酯峰面积。

以化合物的峰面积对浓度作图，绘制标准曲线。结果显示：γ-亚麻酸甲酯在1.2～7.2mg/mL范围内线性良好，线性回归方程为：y=378805x-22（R2=0.9999）。

2.4     精密度试验

精密吸取对照品溶液1μL，连续进样6 次，测定峰面积。结果γ-亚麻酸甲酯色谱峰面积的RSD为1.0%（n = 6），表明仪器精密度良好。

2.5     稳定性试验

取“2.2.2”项下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12h进样分析，测定峰面积计算γ-亚麻酸甲酯的峰面积的RSD为0.96%。稳定性结果表明供试品溶液在12h 内稳定性良好。

2.6     重复性试验

按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项下方法，分别进样，测定峰面积计算γ-亚麻酸甲酯的峰面积的RSD为2.4%（n=6）。表明方法重复性良好。

2.7     回收率试验

回收率试验采用向已知浓度的供试品溶液中加入已知量的γ-亚麻酸甲酯对照品，计算回收率的百分率，见表2。结果表明，回收率均在90.7%～93.7%之间（RSD<3%），符合《中国药典》（2015年版四部通则9101方法测定）。

2.8     含量测定

采用建立的方法对12批月见草子药材进行含量测定，按干燥品测定γ-亚麻酸的含量。结果见表3。

3     讨论

3.1     甲酯化方法考察

分别考察了氢氧化钾-甲醇、三氟化硼-乙醚-甲醇溶液和1%硫酸-甲醇3种方法，其中氢氧化钾-甲醇甲酯化方法测得γ-亚麻酸含量更高，因此选用此方法作为提取方法。

3.2     含量计算方法

通过外标法进行计算，计算结果乘以γ-亚麻酸甲酯和γ-亚麻酸质量分数的比值，再乘以精密称取的脂肪油的重量，最终得出月见草子中γ-亚麻酸的含量[9]。

3.3      本方法的建立弥补了月见草子含量测定的空白

方法学考察及实际样品的测定结果显示，本分析方法在通用性、合理性、耐用性，尤其是准确性和重现性上均体现了中国药典标准所应具有的要素。本方法操作简便而快捷，便于在实际生产及检验中应用，可作为月见草子药材的含量测定方法，也为含有月见草子的中药制剂的标准制备提供了参考。

参考文献

[1]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海科学出版社，1991：51-52.

[2]张永鹤，李景道.月见草子研究概况（综述）[J].延边医学报，1990，（03）：222-223.

[3]顾关云，王欢，蒋昱.月见草的化学、药理与临床研究[J].国外医药（植物药分册），2005，（06）：231-236.

[4]李向高，张福仁.月见草子有效成分的研究[J].中药材科技，1981，（04）：21-22.

[5]王春來.对月见草子入药原因的探讨[J].光明中医，2013（7）：1494-1495.

[6]刘春静，陈月坤，刘荣荣，等.月见草油γ-亚麻酸绝对含量的测定[J].中国油脂，2012，37（01）：69-71.

[7]李香善，魏显苹，金雪梅.毛细管气象色谱法测定月见草油纳米乳中γ-亚麻酸的含量[J].延边大学医学学报，2014，37（2）：123-125.

[8]路萍，赖炳森，王映强，等.毛细管气相色谱内标法测定月见草种子油中γ-亚麻酸的含量[J].中草药，1997（11）：658-660.

[9]黄峥，盛灵慧，马康，等.5种脂肪酸甲酯化方法的酯化效率研究[J].中国油脂，2013，38（09）：86-88.